下面是Edman降解原理:
Edman降解(Edman degradation):是测定蛋白质一级结构的方法,主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。由埃德曼(P.Edman)在上世纪50年代所创立。分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在pH9.0的碱性环境下,将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S,PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物;然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物,将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断,释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物;随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸);最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-氨基酸种类,从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。Edman降解法的优点是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高,因此反应副产物少,用色谱可以准确鉴定。而且对大多数氨基酸残基而言,30 min的耦合反应时间、5 min的切割反应时间都已足够。
现在市面上的柱后衍生有很多种类在行业中也被称为柱后衍生柱后衍生装置或者柱后衍生系统云云,通常这类系统装置主要是用来检测衍生反应使被测物的柱后衍生系统开创了柱后衍生系统性能、价格及外形的新标准。独一无二的反应器设计,造就了新一代柱后衍生系统高性能和低价格。主要的特点在于1、快速且易于设置只需连接一个来自色谱柱的入口,和一个进入检测器的出口,安装即刻完成;2、模块式设计可选单或双反应芯。可同时进行加热反应,常温反应的两步反应过程;可选1台、2台或多台衍生剂泵;降低了接头及管路连接,防止泄漏;全部连接接头均位于前面板上,便于用户使用;3、面板显示,方便设置反应器前面板显示各反应芯的设置温度和实际温度;衍生泵前面板显示每种试剂的流速、压力及压力限,在当前衍生化最为主要的目的就是提高目的物的可检测性。对于GC来讲,多数是为了增强目的物挥发性或者改善目的物极性;对于HPLC来讲多数是为了提高检测器对目的物的相应。2、衍生化分类:柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是在经过分析柱前使分析物与衍生剂反应,反应产物在分析柱上实现分离,实际分离的是衍生产物,检测的也是衍生产物;柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后,在衍生池内与衍生剂反应,在柱子中分离的是目的物,在检测器处检测的衍生产物。
柱前衍生优点是,对设备要求不高,可以手工衍生,而且对衍生时间要求相对宽泛。缺点是,引入了过多的物质,如:衍生剂、衍生产物(当然这个是检测需要的)和衍生副产物,对柱子有潜在的负面影响,另如采用手工衍生也会引入过多的认为因素。柱后衍生优点是,重现性好,认为因素少,引入物质比较少。缺点是,可能有扩散问题,在柱子中分离结束后,就存在扩散,如果衍生慢(必然流速低)、管路长扩散问题就会比较严重,再有就是要求有一套外源的泵系统和一个检测池,对于设备要求较高。在梯度或等梯度洗脱过程,流动相混合不充分会导致基线的周期性波动。在梯度洗脱过程中,当改性剂只加入到水相,或者流动相组分的紫外吸收显著失衡时,混合不充分则更加重了基线的漂移。在第二流动相中添加足够的改性剂以消除吸收率的差别。请注意,同样用量的改性剂在水溶液中和有机相中的吸收率可能不同。一个很好的例子是三氟乙酸(TFA),其在水相中的紫外光谱与乙腈中的不同。乙腈中三氟乙酸(TFA)的用量是水相的85%2.流动相被污染也可能导致基线的问题,所以应该使用新配制的流动相。如果您使用缓冲盐或添加剂,只能使用液相色谱级的,并经常更换的流动相。检测:茚三酮法-紫外检测器:λ1 570nm,λ2 440nm(λref 700nm)OPA法-荧光检测器:λex 330nm,λem 465nm离子交换柱:钠盐1193250,3.0x250mm或锂盐0353150, 3.0x150mm,从1100自动进样器进样阀出口连接0.01英寸内径左右的PEEK管线到PCX 5200的“From Injector”处(注意在PCX 5200仪器上此接头含有一个可更换的0.5u过滤器,因此此处接头必须使用PEEK接头)。4.从PCX 5200的“To Detector”处连接0.01英寸内径左右的不锈钢或PEEK管线到1100荧光检测器流通池入口。5.从1100荧光检测器流通池出口连接0.02英寸内径的PTFE管线到100Psi背压调节器入口(注意100psi背压调节器的目的是Pickering防止温度较高的流动相在λ1 570nm,λ2 440nm(λref 700nm)流通池内爆沸或产生气泡,但也要注意FLD流通池的最高奈压只有20Bar)。www-tianjinlanbo-com柱后衍生装置Pickering用随机的0.02英寸内径的PTFE管线连接100Psi背压调节器出口到废液瓶。倒掉常温下存放超过2天的任何流动相,尤其是那些有利于微生物生长的近中性pH值的流动相。对于柱后反应装置的最低要求是含有一个无脉冲的试剂泵,一个用于混合反应试剂和流动相的混合器以及一个反应器。要完成氨基甲酸酯分析需要两个柱后反应系统串联。如下图所示:在Pickering的设计中,压力表和其后的阻尼用于减少压力脉冲。为保证反应快速还需要对水解过程进行控温,高温又需要一个背压调节器以避免流动相在加热的反应器中沸腾,Pickering的设计还含有一个压力表来监测第一个混合器的压力。加压的试剂瓶可以保证泵在较低的流速下更加精确,同时提供一个惰性气氛以阻止试剂氧化。安全系统也整合到系统中从而避免两个柱后反应系统的隐患:1-过压导致柱后反应器爆裂,2-强碱试剂返流损坏色谱柱,第一个隐患是通过一个525psi的卸压阀来完成,第二个隐患是在系统中增加了一个500psi的安全开关,只有在分析柱上游达到500psi的压力下才允许柱后反应系统操作。单向阀在泵关闭状态时防止试剂虹吸。
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