环境扫描的三种主要模式

随着社会科学技术的不断发展进步，微区信息已经成为了现代物质信息研究的重要组成部分，环境扫描电子显微镜是近年发展起来的新型扫描电镜。它主要用于各种样品的表面形貌观察和成分分析，具有对试样必须干燥、洁净、导电的要求，广泛地应用于生命科学、医学、材料学等诸多学科。本文主要为大家介绍一下环境扫描电子显微镜的工作原理及应用范围。

环境扫描电子显微镜的工作原理

环境扫描电镜(environmental scanning electron microscopy,ESEM)采用多级真空系统、气体二次电子信号探测器等独特设计。观察不导电样品不需要镀导电膜.可以在控制温度、压力、相对湿度和低真空度的条件下进行观察分析含水的、含油的、已污染的、不导电的样品，减少了样品的干燥损伤和真空损伤。

环境扫描电镜有三种工作方式：A）高真空方式(常规方式)；B）低真空方式:0.1~1 Torr；C）环境方式:0.1~20 Torr。

在高真空的常规扫描电镜中，用标准的Everhart Thornley探测器来接受被高能入射电子激发的样品的信号电流(二次电子和部分背散射电子)，经放大后形成图像。

在低真空及环扫模式下，由电子枪发射的高能入射电子束穿过压差光阑进入样品室，射向被测定的样品，从样品表面激发出信号电子:二次电子一SE和背散射电子一BSE。由于样品室内有气体存在，入射电子和信号电子与气体分子碰撞，使之电离产生电子和离子。如果我们在样品和电极板之间加一个稳定电场，电离所产生的电子和离子会被分别引往与各自极性相反的电极方向，非导体表面积累的负电荷会与电离出来的正电荷中和而消除荷电。

图1环境扫描电镜中气体放大原理示意图

其中电子在途中被电场加速到足够高的能量时，会电离更多的气体分子，从而产生更多的电子，如此反复倍增。ESEM探测器正是利用此原理来增强信号的，这又称气体放大原理（如图1）。LFD(低真空度模式下使用的探测器)和GSED（环扫模式下使用的探测器）探头接收这些信号并将其直接传到电子放大器放大成电信号去调制显象管或其它成像系统。

ESEM通过不断地向样品室补充气体来维持样品室的低真空，同时也为气体二次电子探测器GSED提供工作气体，水蒸气是最常用的工作气体。但是样品室中气体分子的存在对于SEM的成像也有着副作用，由于气体分子对入射电子的散射使部分电子改变方向，不落在聚焦点上，从而产生图像的背底噪音同时入射电子使气体分子电离，产生电子和离子，也会加大图像的背底噪音.因而偏压电场的电压、方向及电极板的形状，气体状态(种类、压力等)和入射电子路径等因素都会对图像的分辨率产生影响，必须选择适当的参数才能使分辨率的降低保持在最小的限度。不同的探测器应有不同的工作参数。

环境扫描电子显微镜主要特点（以FEI Quanta为例）

1、FEI ESEM(环境扫描电镜)技术,可在高真空、低真空和环境真空条件下对各种样品进行观察和分析。

2、所有真空条件下的二次电子、背散射电子观察和微观分析。

3、先进的系统结构平台，全数字化系统。

4、可同时安装能谱仪、波谱仪和EBSP系统。

5、可安装低温冷台、加热台、拉伸台等进行样品的动态观察和分析。

环境扫描电子显微镜技术参数（以FEI Quanta 250/450/650为例）

1、分辨率:

二次电子:

高真空模式3.0nm 30kV,8nm 3kV

高真空减速模式7nm 3kV(可选项)

低真空模式3.0nm 30kV,10nm 3kV

环境真空模式3.0nm 30kV

背散射电子4.0nm 30kV

2、样品室压力最高达2600Pa

3、加速电压200V～30kV，连续调节

4、样品台移动范围

Quanta 250:X=Y=50mm

Quanta 450:X=Y=100mm

Quanta 650:X=Y=150mm

环境扫描电子显微镜代表性工作

        

图1杆菌(Bar=10μm)                         图2球菌(Bar=10μm)

        

  图3酵母菌(Bar=5μm)                          图4链霉菌(Bar=5μm)

        

图5真菌(桦南牛肝菌)(Bar=20μm)       图6污水处理中颗粒污泥表面微生物多样性(Bar=10μm)

        

图7水稻叶片表面腊质(野生型)(Bar=5μm)     图8水稻叶片表面腊质(突变体)(Bar=5μm)

观察细胞在材料表面形貌时，用什么染料对细胞染色啊？ 我就是想在普通光镜下观察一下细胞在材料表面的形态，所以想问下这时用什么染料，谢谢大家。zshaop(站内联系TA)如果你的样品是透明的，就不用颜色．．如果不太透明，最好用ＳＥＭ，染色还不如看ＳＥＭcaojun2318(站内联系TA)可以用细胞膜荧光染料，能看见细胞在培养板上的贴壁的形貌dj04164(站内联系TA)最好先固定，样品如果不透明又要光镜看，那就肽酚蓝，考马斯亮蓝，结晶紫，然后拿晶向显微镜看看。透明的话一般的光镜就行了。诺曼底1227(站内联系TA)FITC-鬼笔环肽，用共聚焦显微镜观察，可以看清楚细胞骨架，对于分析细胞在材料表面的形貌还是挺好的。骄阳2007(站内联系TA)FITC-鬼笔环肽是什么，为什么叫鬼笔？

:rol:jingwang7793(站内联系TA)用共聚焦显微镜观察,细胞核和细胞质因染色不同,色彩特别好看. 具体方法要查文献.诺曼底1227(站内联系TA)这是一种荧光染料，就是用鬼笔环肽修饰的FITC，我有同学做过这个，做出来的效果图很漂亮

这是一种荧光染料，就是用鬼笔环肽修饰的FITC，我有同学做过这个，做出来的效果图很漂亮

第一次听说，学习啦，呵呵。效果图能否传上来看看~~诺曼底1227(站内联系TA)效果图你可以在biomaterials上搜一下，一般发在那上面的文章都有用这种图的，当然FITC只是其中一种染料，还有其他的荧光染料可以用的，像罗丹明，calcein-AM and ethidium homodimer-1,这些都有人做，而且效果不错

这是一种荧光染料，就是用鬼笔环肽修饰的FITC，我有同学做过这个，做出来的效果图很漂亮

phalloidin：由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F肌动蛋白的重要试剂。

dj04164(站内联系TA)呵呵，怎么还有人不明白，invetrogen F432，给个效果图， 自己查。绿的是网上找的，红的是我照的。都是伪彩。鬼笔是一种真菌（蘑菇），鬼笔环肽，一种剧毒生物碱，抑制微丝去组装，与CB作用正好相反，与结合微丝，当用FITC标记鬼笔环肽之后可以用它标记细胞微丝（f actin）再不明白的，过来我学校教你。

能看到染色后的荧光情况

目前对木质纤维素原料的预处理方法有物理法、物理化学法、化学法及生物法，各方法各有优缺点，可同时选用多种方法，即组合法。

1.2.1 物理方法

机械粉碎通过剪切或研磨减小原料颗粒尺寸，提高反应面积，同时在一定程度上破坏植物纤维的高级结构，将结晶态纤维素转化成无定形态，使整个大分子结构松散，易于反应。纤维素分解性能与研磨时间和粉碎度直接相关，粒径越小，越容易反应，但需提供的能量也越多，因此存在最佳粉碎尺度。此法不足之处在于通过物理粉碎产生的无定形态非常不稳定，容易重新结晶化，使应用受限。

高能辐射、超声波、微波处理法是通过能量的作用产生物理化学效应，破坏分子间氢键和结晶态结构，降低聚合度，提高酶解速率。Youn 等用60Co的γ射线处理甘蔗渣使还原糖总量提高了约 3 倍。高能辐射可缩短工艺流程、无污染，但成本过高且辐射过程产生的游离基对后续反应有抑制作用。超声波通过能量作用打开氢键，破坏木质素和纤维素结晶区，使纤维的形态结构和超微结构发生变化，有效降低结晶度和规整度，利于酶解；微波处理主要是使物料内部分子发生碰撞，产生热量，导致物料升温，其处理机制为温度效应，研究表明微波可以改变植物纤维原料的超分子结构，使纤维结晶区尺寸发生变化，提高其反应活性。

1.2.2 物理化学方法

高压蒸汽爆破法不添加化学试剂，用高压蒸汽加热原料到一定温度（150~220℃），反应一段时间（10~30min）后迅速降压终止反应。突然减压时，产生二次蒸汽，使体积猛增，受机械力作用，细胞壁结构被破坏，木质素与纤维素分离，而半纤维素在这个过程中被水解并产生有机酸，酸可进一步催化水解得到可溶性糖。此法可去除大部分的半纤维素和少量的木质素，对纤维素几乎没有影响。经蒸汽爆破后的原料孔隙度增大，酶解率明显提高，但会产生有抑制作用的小分子副产物如醛类和有机酸，因此处理后原料需水洗及中和。该法处理费用低，酶解效果明显，已成功用于生产，加拿大Staketech 公司在这方面已取得很大成功。

氨纤维爆破法（AFEX），也称氨冷冻爆破，是利用液氨在相对较低的压力（1.5MPa）和温度(50~80℃)下对原料处理一段时间，然后突然释放压力爆破原料，此过程中液氨迅速汽化产生骤冷，使纤维素结构发生变化。与其他方法不同的是，AFEX 并没有直接分离出木质素和半纤维素，也不产生液态产物，该过程是通过氨与木质素作用改变木质纤维素微结构及超分子结构，使纤维素结构从Ⅰ态转化为Ⅲ态，提高反应活性，可降低酶用量至 1-5 IU/g，大大提高了酶解率。该法避免了高温处理引起的糖变性，不产生抑制性副产物，但成本比较高。类似的还有二氧化碳爆破法，不同的是处理过程中部分 CO2必须形成碳酸，作为后继水解反应的催化剂。

1.2.3 化学法

高温热水处理法是在高温（200℃以上）下，压力高于同温度下饱和蒸汽压时，使用液态水去除部分木质素及全部半纤维素，实质上是酸催化的自水解反应，但高温作用使产物有所损失，并产生一些有机酸抑制酶解及发酵。按水与底物的进料方式不同，分为流动水注入、水与物料相对进料及两者平行进料 3 种，它们都是利用高压液态沸水的高介电常数去溶解几乎所有的半纤维素和 1/3~2/3 的木质素，但反应的 pH 需要控制在 4 到 7 之间，以减少副反应。

稀酸处理植物纤维的研究已有大量报道，尤其在农作物原料中，酸分子的扩散速率很快，且较高温度下符合阿累尼乌斯方程。酸处理多采用稀硫酸（0.5%~1.0%），在 130~200℃与原料反应数分钟。处理后，半纤维素几乎全部水解为单糖（主要为木糖），但也有部分因过度降解转化为乙醛等小分子副产物；纤维素及木质素作为固体残留物不发生变化。半纤维素的转移，增加了纤维素表面积及反应活性，提高水解速率及糖化率。Todd 等通过优化实验条件，可提高还原糖产率至 93%。酸性物质的腐蚀性对反应器材要求高，且化学试剂的加入造成一定污染，该法工艺技术还有待进一步改善。

碱处理是通过碱对纤维素的润涨作用引起分子的消晶和晶格转化，可去除原料中的木质素，保留半纤维素和纤维素。相对酸处理而言，反映条件温和（55~130℃），但易产生不溶性副产物，同时碱用量大，处理时间长，甚至长达数周。最初选用的是 NaOH,它具有较强的脱木质素能力，但有约 50% 的半纤维素过度降解。常用的碱性物质还有熟石灰、氨等。用熟石灰与生物质反应时，氧气/空气的加入可以促进木质素的去除率，提高糖化率；与氨冷冻爆破（AFEX）不同，氨回收过滤法（ARP）是氨在较高温度（150~170℃）下与生物质反应，反应后液态氨被回收再利用。较高温度下，氨溶液可以有效润涨木质纤维素，破坏木质素与半纤维素间的化学键合，降低聚合度，且不会引起糖的降解，该法可有效去除 70%~80%的木质素、水解 40%~60%的半纤维素，保留 95%的纤维素。SEM，X-ray 等分析表明ARP 处理对原料结晶区无影响，但使非结晶区发生了变化，材料孔隙度和表面积明显增加，大大提高了酶解速率。总之碱法中碱耗量大，试剂需回收、中和、洗涤、工序多，应用于大规模生产还有待改进。

氧化处理即利用 O3 或 O2、H2O2 等氧化木质素分子，使其溶出，由此分离木质素和纤维素。常用的还有湿氧化法,即水与空气/氧气在 120℃以上与木质素中酚类物质反应并氧化苯丙烷单元侧链上的烯键，溶解木质素，可保留 70%的纤维素。对半纤维素而言，该法主要是将半纤维素从固相转移到液相，但并不催化液相中的半纤维素水解反应。反应过程产生一些副产物如糠醛及衍生物（如 HMF），对后续反应有一定抑制作用。

1.2.4 生物处理

可分解木质素的天然微生物大多是真菌类，主要有白腐菌、褐腐菌及软腐菌，其中软腐菌分解木质素能力较低，褐腐菌只能改变木质素结构但不能分解木质素，白腐菌分解木质素能力较强，能有效地选择性的分解植物纤维中的木质素。生物法处理条件温和、能耗低、无污染，但周期太长，而且微生物分解木质素的同时也能产生纤维素和半纤维素酶，影响得糖率，有待于通过基因工程或代谢工程选育选择性更强的分解木质素的微生物。

总之，处理方法各异，视具体情况，可协调利用多种方法（组合法）以获得更好效果。如蒸汽爆破法与碱性过氧化物协同作用，微波处理与碱同时作用，沸水处理与氨溶液处理联用等均取得良好效果。预处理方法的选择、工艺过程的设计及工艺参数的确定需要根据原料种类、预处理目的和要求而定，还需兼顾环境友好和低能耗原则。

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