Chip-seq原理篇

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于 转录因子结合位点 或 组蛋白 特异性 修饰位点的研究。

（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；（这一步一般会检测下交联情况）

（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；

（3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；（chip级别的抗体，会有效率问题存在，很考验抗体质量和操作）

（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；

（5）将准备好的样本进行深度测序（一般会准备空白对照，排除假阳性，有两种，1.input DNA：不用任何抗体拉的DNA；2.mock IP DNA：用不含有抗体的DNA）

（1）质量控制，质量可以先用fastqc快速可视化一下，很多上传到geo的数据质量都非常棒，基本不用什么处理，如果需要处理，trimmomatic，cutadapter，trim galore等等。

（2）序列比对，用bowtie2或者bwa都可以（但是这里有一个问题，很多文章他会提到read uniquely mapped 来进行下游分析，bowtie可以通过设置-m 1 参数，但是对于bowtie2以及bwa，并不存在这样的参数，可以使用bwa输出中的XT:A:U(用于标记unique hit)以及tophat中的NH:i:1(用于标记unique hit)来进行过滤，bowtie2则可以根据sam或bam文件的tag来提取)

（3）peak calling，macs（做很长的修饰peak时，可以考虑rseg）

（4）peak注释，Y叔的chipseeker，deeptools也很棒，我看很多文章的profile图都是deeptools画的

是所有的能被探针捕获到的外显子区域，在IGV上面能看到reads都是覆盖到外显子及其侧翼区域。

就是哪些已知的外显子覆盖度不够好，是探针捕获失败还是样本本身变异呢？外显子的哪些区域跟参考基因组序列不一样呢？

是能被转录的区域，不需要是已知的外显子，而且reads是可以跨越外显子比对的！所以分析要点是哪些外显子被 连接起来了 ？每个外显子都被 覆盖 了吗？

测的是目标蛋白结合的DNA序列，取决于目标蛋白的结合能力，所以它的分析要点就是这些DNA序列在基因组的位置。

深度在大部分区域都是均匀的(反应捕获效果，或者拷贝数变异)；

转录组测序一定是不均匀的，一外显子为单位的不均匀(反应表达量差异)；

的测序深度也是不均匀的，以每个碱基为单位的不均匀(反应蛋白结合位点)；

只显示了STAT3基因区域的reads覆盖情况。

首先，测序深度都不高，而且测序深度极度的不稳定，深浅不一；其次，整个STAT3基因区域似乎都有覆盖到。

可以看到只有exon对应的区域是有reads覆盖的，非常exon和intron的间隔非常明显，因为是PE测序，还可以看到不同的exon被同一个read跨越了intron连接起来了。至于测序深度，STAT3基因的大部分exon都是等深度的，但是STAT3基因与其它基因的测序深度就不一样了，这个图没办法显示那么多。

可以看到也是主要覆盖exon区域，但是跟intron区别是没那么整齐的分割线了，因为exon是探针捕获富集的，那么会把exon的侧翼区域也部分捕获， 测序深度会由exon往intron递减。

理论是它应该是全基因组覆盖，而且测序深度非常稳定，但是实际上，测序深度还部分由GC含量，扩增随机性影响。

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