电子显微镜用什么染色可以观察黑白图像

负染色首先由Hall在1955年提出。Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色。

对于负染色的机制目前还不十分了解。对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。

巴氏染色液的染色原理：

核酸等电点为PH1.5-2.0,当PH＞2.0时，能结合带正电荷的苏木素。染料中的伊红、亮绿、橙黄等为酸性染料，俾士麦棕为盐基性染料，能与细胞浆中相反电荷的蛋白质结合，从而染出鲜艳的结构。

细胞学常规染色普遍使用巴氏（Papanicolaou）法，橘黄G与EA36或EA50联合使用可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色，细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料的亲和力较强；而细胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料的亲和力较大。

巴氏染色液正是利用这一特性对细胞进行多色性染色，细胞经染色后能清晰地显示细胞的结构，胞质透亮鲜丽，各种颗粒分明，细胞核染色质非常清楚，从而较容易发现异常细胞。

巴氏染色注意事项：

一、细胞核着色不佳

1、细胞核着色过浅：

（1）盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。需要缩短分化时间或延长碱化时间；每日加入少量新鲜苏木素染液或重新配制苏木素液。

（2）在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色的制片需要严格遵守湿固定的原则。

（3）自来水的PH值偏酸性。使用碱性溶液。

2、细胞核着色过深：

（1）盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。

（2）制片用高于95%以上浓度的酒精固定后可以出现染色过深。应用95%酒精固定。

二、细胞浆着色不佳

1、如果全片内胞浆都淡染，则需要延长染色时间或更换新液。

2、如果胞浆不分色，均为浅红色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此情况可以适当增加染色时间能够部分纠正不分色状况。

3、胞浆染成灰色或紫色，是由于苏木素染色时间过长或盐酸分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以纠正。

4、由于标本的不同，同样配方的EA染液可造成偏蓝、偏绿和偏红，对不同的标本应该使用不同的EA染液。一般认为，EA36和EA50用于妇科标本，而EA65或改良EA用于非妇科标本。

5、胞浆不分色的另一重要原因是由于EA染液的PH值不恰当所致。如染色为红色，可以加少许磷钨酸溶液纠正；如染色均为蓝色或绿色，可以加少许饱和碳酸锂溶液纠正。对于改良EA染液，每100ml染液加入2ml冰醋酸后染色效果更佳；染液使用更持久。

牛流行热进行电子显微镜检查的方法：

1、负性染色法

将受检样品（病毒细胞培养物冻融后的离心上清液）悬浮液一滴（约20μl）滴于蜡盘上。将被覆Formvar膜的铜网，膜面朝下放到液滴上，吸附2～3min。取下铜网，用滤纸吸掉多余的液体。再将该铜网放到PH7、02%磷钨酸染色液上染色1～2min，取下铜网，用滤纸吸掉多余染色液，干燥后，放入电镜进行检查。

2、超薄切片法

将样品（刮下病毒培养小瓶的细胞经离心取其沉淀物）放入4%戊二醇中固定2～4h，用磷酸缓冲液漂洗后，再经1%四氧化锇固定1～2h。脱水：经50%—70%—80%—95%—100%乙醇逐级脱水，其中100%乙醇脱水3次，环氧丙烷过渡2次。包埋：脱过水的样品放入制备好的包埋剂中（主要成分为EPON812h聚合：样品在包埋剂中经32℃浸透过夜，再经70℃聚合96h。切片：将聚合好的组织块放超薄切片机上进行切片。染色：切片经酯酸铀和柠檬酸铝双重染色。然后进行电镜检查。

3、结果

经电镜检查，无论是负性染色，还是超薄切片检查，若为阳性均应出现典型的子弹状或锥形的病毒粒子。

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