为了解决上述问题，西安交通大学胡建教授课题组联合北卡罗来纳州立大学Michael D. Dickey教授团队报道了一种简单的一步法，通过在离子液体中无规共聚两种具有不同溶解度的单体，原位产生相分离的弹性和刚性域，从而获得了超坚韧和可拉伸的P(AAm-co-AA)离子凝胶。研究发现，丙烯酰胺和丙烯酸单体在 1-乙基-3-甲基咪唑乙基硫酸盐（EMIES）中的无规共聚，可以产生宏观上均相的共价网络，并具有原位相分离域。其中，富含聚合物的刚性相通过在聚合物链之间形成氢键来增韧离子凝胶，而富含溶剂的弹性相能够保持机械完整以实现大的应变。所获得的离子凝胶表现出多项创纪录的机械性能：超高断裂强度（12.6 MPa）、断裂能（~24 kJ m-2）和杨氏模量（46.5 MPa）。同时，离子凝胶还表现出高度可拉伸性（~600% 应变），并具有良好的自恢复性和出色的形状记忆特性。
此外，这种一步法还适用于其他单体和离子液体，该项研究为以简单的方式从普通单体中获得坚韧的凝胶提供了一种实用的方法。相关工作以题为“Tough and stretchable ionogels by in situ phase separation”，发表在《Nature Materials》上。
原位相分离实现超坚韧和可拉伸的离子凝胶
众所皆知，在高度溶剂化的凝胶网络中，很少形成氢键，因为溶剂会分离聚合物链，从而产生柔软且可拉伸的凝胶。相反，低溶剂化的网络，虽然硬度较高，但是往往表现出脆性。为了获得兼具强度和韧性的离子凝胶，研究人员计划通过形成由难溶性和高可溶性聚合物成分组成的无规共聚物来解决这个问题，从而在同一网络中形成溶剂化程度低的相（氢键合，刚性）和高度溶剂化的相（离子键，弹性），协同增韧离子凝胶。简单来说，即通过一步法无规共聚在离子凝胶中同时产生两个负责拉伸性和刚度的不同域，从而产生超坚韧和可拉伸的离子凝胶。
在该工作中，研究人员使用离子液体 1-乙基-3-甲基咪唑乙基硫酸盐 (EMIES)作为离子液体溶剂，聚丙烯酸 (PAA) 作为高溶解性聚合物，聚丙烯酰胺 (PAAm) 作为难溶性聚合物。通过将丙烯酰胺和丙烯酸单体加入EMIES离子液体中，然后加入交联剂和光引发剂，在紫外光的诱导下共聚，从而获得了共聚物离子凝胶P(AAm-co-AA)（图 1）。同时，为了对比，研究人员还制备了单一聚合物离子凝胶（PAA ionogel 和 PAAm ionogel）。
图 1：三种离子凝胶的网络结构示意图。
研究发现，单一聚合物 PAA、PAAm 离子凝胶和共聚物离子凝胶在光学和机械性能方面表现出明显的差异。在光学上，纯 PAA (x = 0) 离子凝胶是透明的，纯 PAAm (x = 1) 离子凝胶是不透明的，而P(AAm x-co-AA 1-x) 共聚物离子凝胶的透明度可以通过改变 x 来调节：在 x = 0.8125 时，在 550 nm 处的透射率从接近 0% 突然转变为 ~90%（图2a）。
图2. 三种离子凝胶的光学图片、机械演示和 SEM 图像。
在机械性能方面， PAA ionogel 可拉伸，但仍然无法举起 1 kg 的重量。PAAm 离子凝胶虽然非常坚硬但易碎。相比之下，共聚物离子凝胶表现出可拉伸性和刚度，能够轻易举起1公斤的重量（图2b）。
1+1=10!共聚物离子凝胶的机械性能打破多项纪录！
研究发现，在小应变 (≤10%) 下，共聚物离子凝胶的杨氏模量为46.5 ± 1.9 MPa，接近于纯 PAAm 离子凝胶 (64.7 ± 0.5 MPa),远远超过纯 PAA 离子凝胶（0.12 MPa）和共聚物水凝胶（0.17 MPa）的模量（图 3c）。然而，与纯 PAAm 离子凝胶不同，共聚物离子凝胶是可拉伸的（图 3b）。在生长过程中，富含聚合物的相通过破坏氢键而变形以耗散能量，而富含溶剂的相分散载荷，使共聚物离子凝胶表现出创纪录的断裂强度12.6 ± 0.2 MPa ，是目前报道最强的离子凝胶！相比之下，纯 PAA、PAAm 离子凝胶和共聚物水凝胶的断裂强度不超过3.2 MPa。同时，与现有离子凝胶相比，共聚物离子凝胶还表现出高达~600%)的断裂应变和创纪录的断裂能 (23348 ± 719 J m −2) ，远超目前报道的最佳值（ 4700 J m −2）。
图3. 共聚物离子凝胶的机械性能
此外，悬浮在刚性框架上的膜（厚度 = 0.5 mm）进一步证明了共聚物离子凝胶的显着机械性能。当质量为64g的金属球从 2 m 高度落下时，共聚物水凝胶膜并没有破裂，反而球从共聚物离子凝胶膜上反弹。
纯 PAA 离子凝胶保持溶剂化，形成柔软且纯弹性的网络，而不会耗散能量。 相反，纯 PAAm 离子凝胶会发生相分离，形成硬而脆的网络。AA 和 AAm 在共聚物离子凝胶中的组合提供了两全其美的效果， 富含聚合物的相通过氢键耗散能量，而交联则保留了整个网络，从而赋予其非常高的刚度、韧性和可拉伸性。值得注意的是，尽管由大部分液体组成（~66 wt%），共聚物离子凝胶实现了约 24000 J m -2 的高断裂能和 12.6 MPa 的超高断裂强度，以及高达46.5 MPa的杨氏模量，优于大多数现有的坚韧凝胶、生物组织和天然橡胶。
两种相域的不同玻璃化转变温度赋予共聚物离子凝胶多功能性
此外，超坚韧的共聚物离子凝胶还表现出良好的自恢复性、出色的自愈性和出色的形状记忆性能（图 4和视频3）。
图4. 共聚物离子凝胶的自我恢复、自我修复和形状记忆特性。
共聚物离子凝胶的多功能行为与共聚物离子凝胶的独特特性有关，它具有两个玻璃化转变温度 (Tg)。富含溶剂的区域的 Tg1 为 -42.6 °C，而富含聚合物的区域的 Tg2 为 48.2 °C。高于 Tg2，离子凝胶变成橡胶状，为聚合物链的弹性恢复提供驱动力。因此，在高于 Tg2 的温度下可以观察到形状记忆行为和自愈特性。类似地，在机械变形后，可以通过调节温度来恢复共聚物离子凝胶的形态。
此外，所报道的合成方法不仅限于上述材料，还可以应用于各种聚合物和离子液体的组合，以制备具有定制特性的离子凝胶，这表明其具有广泛的适用性。
参考文献：
1. Wang, M., Zhang, P., S hamsi, M. et al. Tough and stretchable ionogels by in situ phase separation. Nat. Mater. (2022). https://doi.org/10.1038/s41563-022-01195-4
2. Cha, G.D., Kim, DH. Toughness and elasticity from phase separation. Nat. Mater. (2022). https://doi.org/10.1038/s41563-022-01214-4
作者简介
胡建，教授，博导。2006年毕业于浙江大学化工系获得学士学位，2008年毕业于浙江大学化工系高分子化工专业获得硕士学位，随后获得日本文部省奖学金，留学北海道大学生物系，并于2012年获得博士学位。之后在北海道大学化学系从事了三年的博士后工作。2016年4月到西安交通大学航天航空学院全职工作，并入选学校的“青年拔尖人才支持计划”A类（教授）。
目前的研究领域是智能材料、高分子复合材料、软物质力学，研究兴趣主要集中在软物质材料的结构设计和性能分析，研究成果相继发表在Nat. Mater.、J. Am. Chem. Soc.、Nano Letters、Macromolecules等期刊上。
Michael Dickey教授，现为北卡罗来纳州立大学化学和生物分子工程教授。他于1999年佐治亚理工学院获得化学工程学士学位，2003年和2006年分别获得德州大学奥斯汀分校化学工程的硕士和博士学位。自2006开始，他在哈佛大学化学系进行为期三年的博士后工作，随后进入北卡罗来纳州立大学化学和生物分子工程学院进行工作。
Michael Dickey教授团队主要研究工作涉及聚合物薄膜、微流体、软材料、纳米电子学、光伏以及微观和纳米加工的跨学科问题。工作主要是通过简单、廉价和可扩展的方式来构建功能设备，包括可拉伸电子设备、高效太阳能电池、仿生系统、能量收集基板等。在Nat. Mater.、Nat. Commun.、Adv. Mater.等期刊发表论文360余篇，被引次数高达19000余次，H因子为65.
Michael Dickey教授获得很多荣誉和表彰，其中包括ASEE Southeastern Section New Faculty Research Award （2013），University Faculty Scholar （2013），Outstanding Teacher Award - Member of the Academy of Outstanding Teachers at NC State University （2012），Sigma Xi Faculty Award （2011），National Science Foundation CAREER Award（2010）。
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来源：高分子科学前沿
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是指”离子凝胶“，也写为ion-gels. 通常是将一种能导电的液体材料（例如，离子液体）通过化学或者物理的方法与无机材料，高分子材料，碳基材料等混合形成软质的复合材料，即离子凝胶。X技术X技术
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一种在线分离高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备与流程
文档序号：31453360发布日期：2022-09-07 13:53阅读：85来源：国知局
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一种在线分离高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备与流程
1.本发明涉及血液制品的生产方法及设备，具体涉及高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备。
背景技术：
2.人体免疫系统受到抗原（如病毒）刺激后，机体能产生一类特异性结合病毒蛋白（病毒抗原）的免疫球蛋白，即抗体。抗体是机体对付病原入侵（如病毒感染）的重要武器。机体初次受到抗原刺激时，最先产生igm抗体，随后将快速产生大量igg，分布于血液和组织液中，igg持续时间长，是血液中含量最多的一类抗体；接下来还产生iga抗体，分泌到人体对外接触的腔道粘膜表面，发挥免疫防御作用。当然，也还可产生少量的igd和ige抗体。研究发现，绝大多数急性病毒感染性疾病发病1周后出现特异性抗体igm，但igm 4周后基本转阴，而igg持续时间长，下降缓慢。科学家们发现了针对sars冠状病毒（sars-cov）抗体的变化规律，igm抗体在发病10至14天时出现并很快达到高峰，90天时基本消失。igg型抗体可在10至14天时检测到，但滴度较低，60天时达到高峰，90天后仍维持在高水平。并且所有参加调查的康复期患者都发现有igg型抗体存在，这些抗体赋予了康复患者抵御同种病毒再次攻击的能力（news.sina.com.cn/o/2003-05-14/1248122432s.shtml）。康复患者体内产生的抗病毒特异性抗体，能有效地治疗病毒感染患者。
3.有3名医务工作者在感染sars病毒后，采用康复者的血浆治疗，在血液中病毒载量很高的情况下，输注康复者的血浆24小时后，血液中的病毒就被清除了，最后3名医务工作者都健康出院（yeh km, et al. journal of antimicrobial chemotherapy, 2005, 56(5): 919-922.）。除此之外，不少科研文献也报道了血清抗体疗法的有效性。2015年英国研究人员为了给中东呼吸综合征（mers）的紧急治疗提供可行的治疗方案和依据，对过去32个用康复者血浆/血清治疗sars或流感的研究进行了汇总分析，结论认为该疗法可明显降低病毒载量和患者死亡率（mair-jenkins j, saavedra-campos m, baillie j k, et al. 6.the journal of infectious diseases, 2015, 211(1): 80-90.）。另外，研究人员设计了一个多中心、随机、双盲、对照试验，利用从康复者捐献的血浆中提取的抗体，治疗严重甲型h1n1流感患者，结果发现在发病后5天内使用抗体治疗，可有效降低死亡率和病毒载量（hung ifn, et al. chest 2013, 144(2):464-473.）。2021年8日30日，国药集团中国生物研制的静注covid-19人免疫球蛋白（ph4）获得国家药品监督管理局颁发的《药物临床试验批件》，批准开展临床试验。综上所述，康复患者的血浆中提取特异性抗体并经过高度提纯后的静注人免疫球蛋白是治疗重症患者的首选特效药。
4.目前关于人血浆中免疫球蛋白的制备方法都是以cohn组分为原料进行进行分离，主要通过低温乙醇沉淀或辛酸沉淀，然后经阴离子交换层析、硅藻土压滤、纳米膜除病毒，除菌过滤等方式制备，只是在具体工艺参数的设置上有所不同。
5.博雅生物公开了一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺（cn104231075a）及一种狂犬病人免疫球蛋白制备工艺（cn104193822a），包括低温乙醇压滤法、阴离子层析法、超滤
法、纳米过滤法、二次超滤和洗烘灌联动分装工艺技术提取分离免疫球蛋白。
6.国药集团武汉血液制品有限公司公开了一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法，采集含有covid-19抗体的血浆经低温乙醇沉淀，超滤，除菌除病毒后获得静注covid-19人免疫球蛋白。
7.深圳卫光生物公开了静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的制备方法（cn102286099a），采用辛酸沉淀和阴离子交换层析的方法。该公司也公开了新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法（cn112375142a），收集病人的血浆进行病毒灭活后用protein a和protein g两种亲和凝胶分别捕获血浆中igg1、igg2、igg4和igg3亚型，亲和层析后再用阴离子凝胶进一步纯化，去除白蛋白、iga、igm杂质，获得静注人免疫球蛋白。
8.cn104001172a公开了乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，用辛酸沉淀和阴离子交换层析的方法制备。cn112225799a和cn112010968a公开了自动化分离系统快速提取covid-19患者康复期血浆的方法，将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离成三个组分层：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层，接着将得到血浆进行病毒灭活，任选地将所该血浆冻存，得到可用于制备静注免疫球蛋白g的血浆。再经低温乙醇沉淀方法制备静注免疫球蛋白g。
9.cn105126100a 公开了一种富含igm的人免疫球蛋白制剂及其制备方法，通过不同的缓冲液洗脱将iga和igm分开，然后取igm组分与igg混合，得到免疫球蛋白制剂。cn101591392b公开了肠道病毒7i型静注人免疫球蛋白的制备方法，取富含抗体的血浆经低温乙醇沉淀和层析法制备而成。cn105037487a 公开了一种人血白蛋白的制备方法，用乙醇沉淀和离子交换层析的方法制备。
10.上述纯化方法均需要先采集病人的血浆，进行病毒灭活处理后再进行纯化，需要大量的血浆，特别是针对某一种疾病传染初期，特异性病人血浆来源更少，不利于短期大量储存以满足应急需要。还需开发更多的更有效的特异性抗体获取方法。
技术实现要素：
11.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备。
12.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供：一种在线制备高纯度免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：将血浆引入蛋白a免疫吸附柱，吸附完成后进行洗脱；收集洗脱液，在线稀释后经过阴离子交换膜纯化，使用截留分子量为6kd的中空纤维膜超滤浓缩置换缓冲液，然后用截留分子量为200kd的中空纤维膜除去多聚体，最后用纳滤膜除病毒，除菌过滤即得到可静脉注射的免疫球蛋白。
13.在一些方法的实例中，在蛋白a免疫吸附柱饱和后，使用平衡液平衡后，之后使用洗脱液洗脱；其中：所述平衡液为ph=7.0-7.5 的磷酸缓冲液；和/或所述洗脱液为ph 2.8-4.0，100mm~150mm的甘氨酸缓冲液或枸橼酸含量为0.19％～0.24％的枸橼酸缓冲液。
14.在一些方法的实例中，所述洗脱液经hac-naac缓冲液稀释后进入离子交换膜；和/或所述阴离子交换膜表面基团为季氨基；和/或所用蛋白a免疫吸附柱的配基为经改造的重组蛋白a，对人igg吸附性能较高，对iga和igm吸附性能较低；和/或所述免疫球蛋白中，iga含量低于0.05%、igm含量低于0.001%、免疫球蛋白多聚体含量低于1.5%，二聚体含量低于2.5%。
15.在一些方法的实例中，所述hac-naac缓冲液的ph为6.50～7.0，离子浓度为0.1～0.15m。
16.在一些方法的实例中，所述中空纤维膜超滤浓缩时将缓冲液置换为ph=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液；和/或浓缩至蛋白浓度大于50mg/ml时停止浓缩。
17.在一些方法的实例中，所述血浆为病毒感染后康复者或接种疫苗后的健康人体的血浆，用于分离提纯特用于重症患者特异性治疗的抗体。
18.在一些方法的实例中，所述病毒选自sars病毒、mers病毒、sars-cov-2病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、流感病毒、手足口病毒、呼吸道合胞病毒；所述疫苗为抗sars病毒、mers病毒、sars-cov-2病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、流感病毒、手足口病毒或呼吸道合胞病毒的疫苗。
19.本发明的第二个方面，提供：一种高纯度免疫球蛋白的生产装置，包括：第一储液区，用于储存多种溶液；蛋白a免疫吸附柱，其进液端通过管路与第一储液区连通，其出液端通过管路与废液袋、离子交换膜相连通；离子交换膜，其进液端分别与蛋白a免疫吸附柱和第二储液区连通，其出液端与中空纤维膜的进液端相连通，所述中空纤维膜的截留分子量为6kd和200kd；中空纤维膜，其进液端分别与离子交换膜的出液端和第三储液区连通，其出液端与废液袋、纳滤除菌膜相连通，所述纳滤除菌膜的出液端与成品收集袋相连通。
20.在一些生产装置的实例中，所述蛋白a免疫吸附柱的进液端还通过管路与所述血浆分离器的血浆出口相连通，蛋白a免疫吸附柱的出口端通过管路与所述血浆分离器的血细胞出口相连通，吸附后的血浆与血细胞混合后回输至人体内；所述血浆分离器的进液端还连通有第四储液区。
21.在一些生产装置的实例中，所述第一储液区的溶液包括：第一预冲洗液、平衡液、洗脱液；所述第二储液区的溶液包括hac-naac缓冲液；所述第三储液区的溶液包括ph=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液；所述第四储液区的溶液包括第二预冲洗液。
22.本发明的有益效果是：本发明一些实例的方法，只需要两步层析技术即得到符合药典静注人免疫球蛋白（ph 4）标准的蛋白溶液，得到的免疫球蛋白溶液的蛋白质含量大于50g/l，纯度大于95%。该方法操作简单，快速。
23.本发明一些实例的方法，使用6kd孔径的中空纤维膜进行超滤浓缩置换缓冲液，然后用200kd的中空纤维膜除去多聚体，因igg单体大小150kd，而iga部分以二聚体形式存在，igm以五聚体的超大分子存在。用200kd的孔径进行浓缩能够去除免疫球蛋白中的多聚体，使多聚体含量低于1.5%，二聚体含量低于2.5%，最大限度保证收集到的免疫球蛋白以单体形式存在，蛋白活性和安全性更高。
24.本发明一些实例的方法，通过低ph (2.8-4.0)洗脱及纳滤除病毒，过滤除菌工艺保证了产品的安全性。
25.本发明一些实例的方法，使用cn102698717b和cn110026166b的蛋白a吸附材料作为蛋白a免疫吸附柱的配基，该吸附柱对igg的吸附性能大大增加，通过竞争抑制作用，降低了对iga、igm的吸附，有利于获得更纯的免疫球蛋白溶液。该蛋白a免疫吸附柱已通过国家三类医疗器械认证（国械注准20143102368），用于临床上吸附以igg为主(或属于igg型)的抗体。该产品自2016年应用于临床治疗以来，已经在全国上百家医院完成上千例患者的治疗，安全性和有效性已得到充分证实。蛋白a吸附柱的配基重组葡萄球菌蛋白a能够特异性结合人igg的fc段，选择性高。蛋白a免疫吸附方法每次可从一例康复患者体内分离出15-20克免疫球蛋白，吸附后的血浆回输至康复者体内，不需要康复者捐献血浆。所以一般而言，捐献者可以多次捐献，每隔几天就可以捐献一次。而传统方法一次献血（全血）不超过400ml（内含血浆约200-240ml），并且半年内只能捐献一次，每次仅能利用或提取约2-3克。特别是在传染病爆发初期，康复者人群极少，几乎无法采集到大量的血浆，临床应用受限。本发明中的特异性免疫球蛋白分离系统，约4h 即可以从一例康复者中提取到15g以上的抗体，满足更多的患者需要。
26.本发明一些实例的方法，通过可用于临床的蛋白a免疫吸附柱、阴离子交换膜、除病毒、除菌等步骤制备成蛋白浓度达到50mg/ml 以上的可用于临床的注射药物。
27.本发明一些实例的方法，通过调节离子交换膜缓冲液的ph至6.5-7.0，使得iga和igm (iga的等电点为7.4，igm的等电点为7.0)不易吸附至填料上，从而进一步提高igg的纯度。同时，通过大孔径的中空纤维膜过滤，有效去除了抗体中的iga、igm多聚体，提高了蛋白的纯度及安全性。
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