伯乐pcr如何查导出ct值定性

荧光定量PCR(qPCR)使用和数据分析（伯乐篇）

空谷临风

病毒进化

该文章仅适合伯乐（BIO-RAD）仪器的qPCR实验及数据分析

荧光定量（qPCR）程序运行

创建一个新的程序，或者选已经创建好的文件，下一步

选择正确的板子类型，下一步

直接点击Start Run

数据分析

1 使用伯乐的CFX Maestro软件直接查看

选择Gene Expression——Plate Setup——view plate

选中PCR孔，

Target Names是组名填基因的名字或者是管家/内参基因（Actin）

Sample Names填样品的名称

关掉表格，选择是

选择Actin作为内参基因，点击OK

就可以用软件查看基因表达量了。

2 将运行的结果导出，用GraphPad展示

将下边这部分数据导入到GraphPad

选择Mean &SEM

将Expression的数据填入Mean列，将Corrected Expression SEM填入SEM列

点击表格对应的Graphs。

变性-退火-延伸（图1）。

PCR中DNA的合成过程均以两个引物特异性结合处为起点。

引物 通常是分别取自靶DNA序列两条链的3’端相向的长度在16~25nt的单链DNA片段，即引物头是5’，尾是3’。引物自身为靶DNA一端的互补序列，最终成为产物的组成部分。

耐热的DNA聚合酶 。在已发现的耐热DNA聚合酶中， Taq pol的活性最高，达200000U/mg，反应的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150-300个核苷酸/（秒·酶分子）。该酶具 5’->3’外切酶活性 ，不具3’->5’外切酶活性，故其不具Klenow酶的校对功能，在扩增过程中引起碱基错配概率大大增加，概率约1/300-1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中平均每400个碱基就有一个与原始序列不同。 Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶的活性（非模板依赖的聚合活性），特别对dATP的聚合能力最高，利用这一特性，我们可以构建dT-载体克隆dA尾的产物。同样，利用Klenow酶可以去除3’尾巴，生成平末端的产物。除 Taq pol，人们还陆续发现和获得了其他几种耐热DNA聚合酶，如 Th DNA聚合酶、 Vent DNA聚合酶、 Sac DNA聚合酶以及修饰 Taq pol聚合酶等。

延伸温度与时间 。尽管 Taq pol在75-80℃时活性最高，通常采用的延伸温度为72℃，此时的碱基掺入率约35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。通常扩增1kb以内的DNA片段延伸1min即可，而当代增序列长达3-4kb时，则需延长3-4min；然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤，因为在退火温度下 Taq pol的活性已足以完成靶序列的合成。通常PCR最后一轮循环中可以适当将延长时间延长至4~10min，以使PCR反应完全提高扩增产量。在实际操作中，应注意前几轮循环的延伸时间要足够，以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。此外当待扩增DNA浓度较低时，由于碱基掺入率较低，可适当的延长反应延伸时间。

PCR终产物 分为复杂产物和长度特异产物两部分（图2）。 长度特异产物 是长度严格限定在两个引物链的5’端之间，是特异的目标片段。 复杂产物片段 是以包含有目标序列的初始DNA片段为模板所合成的PCR产物，其5’端为引物序列，而其3’端则远超出另一引物的结合区，以及以这样的DNA链为模板，另一引物结合并延伸形成的一端为双链特异产物部分，另一端为单链的复杂PCR产物。形成复杂产物片段的原因是：新合成的两条DNA链5’端分别是两引物的5’端，是固定不变的，而3’端则没有固定的止点，长短不一（其止点与模板长度、PCR延伸设定时间有关）。长度特异性产物因扩增长度一致（反应到目的片段的最后一个碱基即停止），而呈指数倍性（2 n ）增加。复杂产物片段以算数倍数（2n）增加，且有多种长度类型，导致每个特定分子质量的复杂产物片段的拷贝数很少，相比长度特异性产物其在PCR总产物中几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物无需再纯化，就能保证足够的纯度用于随后的分析与检验。

PCR产物量 可用 P=N×(1+E) n 计算。P代表PCR产物的拷贝数，E代表平均每个热循环的PCR扩增效率，N代表起始模板拷贝数，n代表热循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。产物增长整体呈现“指数-线形-平台”模式（图3）。初期，因DNA聚合酶活力足、dNTP底物充足，模板浓度低而自身复性少，PCR扩增效率非常接近100%，产物呈现“指数”增长模式。随反应进行，受DNA聚合酶活力下降等原因，PCR效率接近0，最终停止反应而进入平台期。绝大多数情况下，经过 35 个循环，PCR扩增都将进入到平台期。

[1] 王廷华, 刘佳, 夏庆杰. PCR理论与技术[M]. 第三版. 背景:科学出版社, 2013:1-22.

实时荧光定量PCR即

Real time PCR(也称实时定量PCR)

定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

实时荧光定量PCR 技术的主要应用：

1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等

2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证

3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等

Realtime PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）

SYBR green

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法适用：

1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上

2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。

3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。

4、高通量大规模的定量PCR检测

5、专一性要求不高的定量PCR检测。

Taqman Probe

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

此方法适用：

1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。

2、适用于扩增序列专一的体系的检测。

3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。

4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。

5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。

6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。

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