冰冻切片的制作步骤及每个步骤的要求和作用？

冷冻切片 1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。 2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5~10μm间。 4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带 ，可避免组织摊片过程中皱折 ，保证组织结构的完整及切片的美观。 注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织，普通胶水或 OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。 （OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。） ②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻，约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上，组织周围再加一些胶，再次置于冷冻机中冷冻，这样组织被垫高，就能快速切出高质量的切片。 ③冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬，切片碎裂，出现梯田状薄厚不均或空洞；反之，温度过高，组织块硬度不够 ，切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。 ④当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 另者，调高冰冻点。 ⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。 如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。 四、常用冰冻切片苏木精—伊红染色 染色步骤：1、冰冻切片用10%甲醛固定1~5分钟，流水冲洗2分钟，蒸馏水浸洗3分钟。 2、苏木精1~2分钟。自来水快洗。 3、0。5%盐酸乙醇分色1~2秒。 蒸馏水快洗。 4、0。25%~0。5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗30秒~1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。 5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。 6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。 7、100%乙醇2次，每次1~2分钟。 8、二甲苯2次，每次1~2分钟。中性树胶封固。 注：①结束阶段的二甲苯作用为透明，其目的是增强标本的折光率，达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率，导致光镜观察细微结构不清楚的结果。 另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。 ②HE染色的水洗：整个染色过程中共5处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。 苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性（棕红色）转变为弱碱性（蓝色），导致“有色沉淀”出现与积累，致使染色结果为黑蓝色。 苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染料成分，即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。 分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液（0。5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。 过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。 蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水），为伊红染色提供适宜的染色环境。 五、冰冻切片的快速染色法 ① 切片固定30秒-1分钟。 ② 水洗（10秒）。 ③ 染苏木素3-5分钟。自来水冲洗片刻。（在组织上加苏木精染液数滴，放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干） ④分化（1%酸乙醇分化）。 ⑤ 于碱水（氨水）中返蓝20秒。 ⑥ 伊红染色10-20秒。 ⑦脱水，透明，中性树胶封固。 注：固定液的选择 A中性福尔马林溶液 B 95%乙醇 C AF(40%福尔马林10ml,95%乙醇90ml) D Carnoy（纯乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml） E Clzrke改良液[4]（纯乙醇95ml，冰醋酸5ml） F Bouin液（饱和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液 25ml，冰醋酸5ml） 6种固定液固定后的组织切片染色效果各有差异，其中C 固定液固定的切片染色效果最好，组织结构清晰，核染色鲜艳，核无明显肿胀，核浆对比度好，镜下与石蜡切片相似（图1）。 D 液、E 液、F 液染色效果均较好，结构较清晰， 核染色较鲜艳，但核有肿胀，核轮廓有些模糊。A 液染色效果较差，组织结构尚清楚，但细胞核肿胀比较明显且境界模糊不清（图2）。B 液染色效果差，核着色不良，结构模糊。 甲醛、乙醇、冰醋酸

我看到下面第4条说，冷冻切片不需要固定液，我不是专业的我不懂，呵呵。还有看到的是空细胞是不是热染色没做好，没把细胞液成分染出来。

冰冻切片时的注意事项： ①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓

“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 ④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

4．冰冻切片的快速染色法 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

---