如何看QRT-PCR 结果中的Cq值

这样算：

你先把几次试验的对照组的平均值设为1, 再把每个单独试验对照组的数值算出和这个对照组平均值的差异，就可以计算标准差了。

这么简单的统计分析，用不着SPSS吧， excel就可以解决了。

追问 : 谢谢您，可是我还是有点不明白：如果我重复三次，每次3个复孔（即一共9个孔），您指的“把几次试验的对照组的平均值设为1”是指把对照组的ΔCT还是ΔΔCT还是2的-ΔΔCT的平均值设为1啊？谢谢！

追答 : 首先，你重复做一个样本（3个重复的孔），那只能算一个值（取平均）。 我说的1是指的相对表达量，不是ΔCT。你得到每个样本中目的基因和内参的CT值后，就可以算出相对表达量了，对不对？ 这时，取所有对照组的平均值，设为1. 每次实验的对照组再和这个平均值1比较，就是对照组的标准差了。

追问 : 您所说的目的基因和内参的CT值相减得到的不就是ΔCT吗？假设三次实验某一基因的对照组的均值为4，5，6，则均值为5，此时把5设为1，然后再怎么算啊？不好意思麻烦您再解答一下，非常感谢

追答 : 按照你说的，5为平均值，那三个组分别和5比较，不就是-1， 0， 1三个值吗。得到的相对表达量就是0.5， 1 和2. 不管是CT值还是表达量，你都可以算出标准差，做出error bar了。

追问 : 我知道了，可是这样出来的error bar好大啊，给人感觉误差会很大呀

追答 : 这个error bar反应的是真实的差异啊，怎么会给人误差很大的感觉呢，我只是举了个例子，实际上你只要加样量控制的好，对照组的误差都是很小的。不会出现4， 5， 6这样的差异，一般都是在小数点后的差异

一、原理

在指数阶段，PCR 产物的量在每个循环中大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应组分被消耗，最终一种或多种组分变得有限。此时，反应减慢并进入平台期。

最初，荧光保持在背景水平，即使产物以指数方式累积，也无法检测到荧光的增加。最终，足够的扩增产物积累以产生可检测的荧光信号。

发生这种情况的循环数称为量化循环，或 q。由于 q值是在试剂不受限制的指数阶段测量的，因此可以使用实时 qPCR 根据描述反应进程的已知指数函数可靠和准确地计算反应中存在的模板的初始量。

反应的 Cq主要由扩增反应开始时存在的模板量决定。如果在反应开始时存在大量模板，则需要相对较少的扩增循环来积累足够的产物以产生高于背景的荧光信号。因此，反应将具有低的或早期的 Cq。

二、应用

实时荧光定量 PCR/qPCR 检测已成为快速、灵敏地测定和定量各种生物样品中核酸的首选工具，具有多种应用，例如基因表达分析、食品中转基因生物的检测和癌症表型分析.

在研究实验室中，qPCR 测定广泛用于定量测量转化细胞系中的基因拷贝数（基因剂量）或突变基因的存在。与逆转录 PCR (RT-PCR) 相结合，qPCR 分析可用于精确定量基因表达的变化，例如，通过测量细胞的变化，响应不同环境条件或药物治疗的表达增加或减少mRNA水平。

qPCR/实时 PCR 仪器

实时 PCR 检测系统由配备光学检测模块的热循环仪组成，用于测量每个扩增循环期间荧光团与目标序列结合时产生的荧光信号。

Bio-Rad 实时 PCR 检测系统具有热循环仪和可互换的模块，用于荧光团的单重和多重检测以及固定的实时 PCR 单元。所有 qPCR 系统都具有热梯度功能。

做过PCR的小伙伴都知道，PCR前期的验证引物探针性能和确定最适反应条件是确保正式实验顺利进行的前提。PCR实验中有个相当重要的工作——即是PCR扩增效率的评估。扩增效率是PCR检测性能最重要的指标之一，也是定量分析计算结果时所需要的参数。接下来，让我给大家细细说来吧。

什么是扩增效率

PCR是一种DNA体外扩增技术，通常包括了30 - 50个循环周期。每个循环中，目标DNA分子的拷贝数最多会增加1倍。但在实际反应中，1个DNA分子在1个扩增循环后被成功复制的概率，也就是扩增效率E<1。而PCR的特点是反应初期目标DNA分子呈现指数增长，这个阶段的扩增效率可以无限接近于1；随后由于反应组分消耗或聚合酶活性下降或两者共同作用，导致反应效率逐渐下降并最终停止。不管是定量DNA分子初始量，还是计算表达量差异，都需要精确评估PCR扩增效率。

如何评估扩增效率

标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法，被研究者们广泛认可。该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。这些样品通常由浓缩的原液连续稀释而成，最常用的是10倍稀释。使用一系列稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值，最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

影响扩增效率的关键因素

PCR的效率取决于许多因素，包括以下方面：

1）检测的性能。这取决于引物、模板的序列和结构。二级结构和分子间的相互作用都会降低PCR效率。

2）样品基质。其中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质，或携带来自上游加工步骤的试剂。检测样品是否有抑制作用，可使用RNA或DNA Spikes方法进行检测，或者通过倍比稀释得到标准曲线也可以观察到。

3）所用试剂及其浓度。本质上，任何PCR试剂都会一定程度上限制PCR反应速率和性能。

4）竞争性反应。多重反应时，各基因的扩增存在反应成分的竞争。

5）qPCR仪器。由于仪器特定的硬件/软件属性和设置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的实验中，不同的仪器会产生不同的PCR效率。

6）技术重复。一般进行3次以上的技术重复以校正实验误差，重复数越多精确度越高。

7）连续稀释中的移液体积。移液体积越大，移液器误差或操作误差引起的影响越小。

qPCR扩增效率的判断

qPCR扩增效率主要是通过标准曲线的线性关系方程Cq=-klgX0+b来判断，扩增效率E在90%-110%之间时，认为扩增接近理想情况；参数R2要求≥0.98，R2越接近1，则说明Cq和X0的Log值之间的相关性越高。

那么扩增效率E表现不好，主要分为两种情况：

1）过低的扩增效率（<90％）

可能存在的原因：

☑ 移液器校准不良或移液技术差。

☑ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

☑ 染料浓度低荧光或者仪器未校准染料。

☑ 引物设计不好或扩增子具有二级结构。

☑ 标准曲线动态范围太小。

☑ Taq酶无活性或活性降低。

☑ 样品抑制。

2）过高的扩增效率（>110％）

可能存在的原因：

☑ 移液器校准不良或移液技术差。

☑ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

☑ 引物二聚体或非特异性扩增。

☑ 标准曲线动态范围太小。

☑ 基因组DNA污染（仅限RNA模板未进行DNase I处理或DNase I消化不完全）。

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