悬浮细胞漂在培养液中,呈圆形,晃动培养液时细胞也随着漂动
动物细胞贴壁培养的方法有组织块培养法和消化培养法。
贴壁细胞培养方法操作步骤 :
1.用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出,用无菌丝绸布擦拭干净,不要用纱布;
2.将盖玻片轻轻放入6孔培养板(每孔一片)或培养皿中(每个平皿可放置2-3片);
3.在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时;
4.将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中,使盖玻片完全浸在培养液中;
5.将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时,将培养板取出,用盖片镊轻轻取出盖玻
片,用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
实验要点及说明 :
1.本方法适用于贴壁细胞培养,而不适用于悬浮细胞培养,悬浮细胞可使用滴片法;
2.所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造,并经过铬酸洗液处理;
3.盖玻片非常薄,易碎,取放盖玻片时动作要轻;
4.如果需要更多生长状态一致的细胞,可以使用较大的培养皿,但不宜过大,以避免培养液的浪费和增加污染机率;
5.如果细胞贴壁生长能力较差,可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。
贴壁培养的优点:
容易更换培养液;细胞紧密黏附于固相表面,可直接倾去旧培养液,清洗后直接加入新培养液。
容易采用灌注培养,从而达到提高细胞密度的目的;因细胞固定表面,不需过滤系统。
当细胞贴壁于生长基质时,很多细胞将更有效的表达一种产品。
同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
适用于所有类型细胞。
贴壁培养的缺点:与悬浮培养法相比
扩大培养比较困难,投资大;
占地面积大;
不能有效监测细胞的生长;
细胞培养首先分为原代培养和传代培养.一、原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存;
二、传代培养首先进行细胞复苏:
1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.
2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液;也可复苏当时离心(1000rpm 5min左右)后,完全培养基重悬培养,适时换液.
细胞传代:
1.贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心(1000rpm 5min左右),新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验.
2.悬浮细胞:
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换新培养基,可先离心(1000rpm,5min左右)后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.
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