家兔小肠平滑肌环境条件

家兔小肠平滑肌环境条件，消化道平滑肌的一般生理特性：

收缩迟缓：舒缩运动≥ 20S/次。

富有伸展性：伸长可达原来长度2—3倍。

紧张性：常保持一种微弱的持续收缩状态。

节律性收缩：离体后于合适环境中仍能节律性收缩。

对电刺激不敏感，对化学、机械等刺激敏感。

小肠平滑肌也具有上述生理特性。

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实验原理和背景知识

小肠运动受到神经和体液的调节

一、实验设计的基本原则

药理学研究的目的是通过动物实验来认识药物作用的特点和规律,为开发新药和评价药物提供科学依据.由于生物学研究普遍存在的个体差异,要取得精确可靠的实验结论必须进行科学的实验设计,因此必须遵循以下基本原则.

1、重复:

“重复”包括两方面的内容,即良好的重复稳定性(或称重现性)和足够的重复数,两者含意不同又紧密联系.有了足够的重复数才会取得较高的重现性,为了得到统计学所要求的重现性,必须选择相应的适当的重复数.

统计学中的显著性检验规定的P<0.05及P<0.01反映了重现性的高低“P”表示不能重现的概率.在已达到良好的重现性的条件下,如果P值相同,重复数越多的实验,其价值越小.它说明实验误差波动太大,或是两药的均数相差太小.前者提示实验方法应予改进,后者提示两药药效的差别没有临床意义.可见,靠增加实验例数来提高重现性是有一定限度的.

1.1 实验重复数的质量

除了重复数的数量问题外,还应重视重复数的质量问题.要尽量采用精密、准确的实验方法,以减少实验误差.同时应保证每次重复都是在同等情况下进行.即实验时间、地点、条件,动物品系、批次,药品厂商、批号,临床病情的构成比或动物病理模型的轻重分布应当相同.质量不高的重复,不仅浪费人力和物力,有时还会导致错误的结论.

1.2 药理实验设计中的例数问题

实验结论的重现性与可靠性同实验例数有关,实验质量越高、误差越小,所需例数越少,但最少也不能少于“基本例数”.

实验动物的基本例数

(1)小动物(小鼠、大鼠、鱼、蛙):计量资料每组10例,计数资料每组30例.

(2)中动物(兔、豚鼠):计量资料每组6例,计数资料每组20例.

(3)大动物(犬、猫、猴、羊):计量计数资料每组5例,计数资料每组10例.

2、随机:

“随机”指每个实验对象在接受处理(用药、化验、分组、抽样等等)时,都有相等的机会,随机遇而定.随机可减轻主观因素的干扰,减少或避免偏性误差,是实验设计中的重要原则之一.

随机抽样的方案有以下几种:

2.1 单纯随机

所有个体(病人或动物)完全按随机原则(随机数字表或抽签)抽样分配.本法虽然做到绝对随机,但在例数不多时,往往难以保证各组中性别、年龄、病情轻重等的构成比基本一致,在药理实验中较少应用.

2.2 均衡随机

又称分层随机.首先将易于控制且对实验影响较大的因素作为分层指标,人为地使各组在这些指标上达到均衡一致.再按随机原则将各个体分配到各组.使各组在性别、年龄、病情轻重等的构成比上基本一致.该法在药理学实验中常用,如先将同一批次动物(种属、年龄相同)按性别分为2大组,雌雄动物总数应当相同(雌雄各半).每大组动物再分别按体重分笼,先从体重轻的笼中逐一抓取动物,按循环分组发分别放入各组的笼中,待该体重动物分配完毕后,从体重次轻的笼中继续抓取动物分组,…… 直至体重最重的笼中动物分配完毕. 2.3 均衡顺序随机

该法主要用于临床或动物病理模型的抽样分组.即对病情、性别、年龄等重要因素进行均衡处理,其他次要因素则仅作记录,不作分组依据.先根据主要因素画一个分层表,然后根据病人就诊顺序依次按均衡的层次交替进行分组.例如准备将病情及性别加以均衡的临床试验分组情况见下表(病人总数22人),最后分组结果达到在病情及性别基本均衡.

均衡顺序随机分组表

Balance ordering random grouping

均衡层次开始组别 按就诊顺序分层交替分为A,B组 共计Total

Balance degree Group No.1 Grouped alternately as clinical ordering to A and B A B

病重 男(M) A 1A,2B,3A,4B,5A,6B,11A,13B4 4

Bad 女(F) B 7B,15A,16B,17A,18B 2 3

病轻 男(M) B 8B,9A,10B,19A,20B,22A3 3

Mild 女(F) A 12A,14B,21A 2 1

3、对照:

“对照”是比较的基础,没有对照就没有比较,没有鉴别.对照组的类型很多,将在后面加以介绍.对照应符合“齐同可比”的原则,除了要研究的因素(如用药)外,对照组的其他一切条件应与给药组完全相同,才具有可比性.

3.1 分组的类型

3.1.1 阴性对照组即不含研究中处理因素(用药)的对照,应产生阴性结果.

(1)空白对照:不给任何处理的对照,多用于给药前后对比,两组对比时较为少用.

(2)假处理对照:经过除用药外的其它一切相同处理(麻醉、注射、手术等),所用注射液体在pH、渗透压、溶媒等均与用药组相同,可比性好,两组对比时常用.

(3)安慰剂对照:用于临床研究,采用外形、气味相同,但不含主药(改用乳糖或淀粉)的制剂作对照组药物,以排除病人的心理因素的影响.

3.1.2 阳性对照组:采用已肯定疗效的药物作为对照,应产生阳性结果.如果没有阳性结果出现,说明实验方法有待改进.

(1)标准品对照:采用标准药物或典型药物作为对照,以提供对比标准,便于评定药物效价.

(2)弱阳性对照:采用疗效不够理想的传统疗法或老药作为对照,可代替安慰剂使用.

3.1.3 实验用药组

(1)不同剂量:可阐明量－效关系,证明疗效确由药物引起还可避免因剂量选择不当而错误淘汰有价值的新药.一般采用3～5个剂量组,离体平滑肌实验组间剂量比为10,整体脏器活动为3.16或2, 整体效应为1.78或1.41.

(2)不同制剂:将提取的各种有效组分、不同提取部分或不同方式提取的产物,同时进行药效对比,以了解哪种最为有效.

(3)不同组合:用于分析药物间的相互作用,多采用正交设计法安排组合方式.

3.2 对比的性质

3.2.1 自身对比:又称同体对比、前后对比,为同一个体用药前后、或身体左右侧用药的对比.可大幅度较少个体差异,但要注意前后两次机体状况是否有自然变异.

3.2.2 配对对比:采用同种、同窝、同性别、同体重的动物,一一配对.可减实验误差,提高实验效率,但要注意不可滥用.

3.2.3 组间对比:药理实验中应用最广的对比.注意非用药因素要尽可能一致,以减少误差.

下面几种对比是对比的特殊情况.

3.2.4 交叉对比:同一个体前后两次分别接受甲乙两药治疗.一组动物先用甲药,后用乙药,另一组动物先用乙药,后用甲药.两次用药期间可根据实验性质休息一定时间,以避免前药对后药的影响.动物实验或临床研究中均可应用,主要适用于病程较长的疾病或病理模型.

3.2.5 历史对比:利用个人既往经验、过去的病历记录或历史文献资料作为对比.可比性差,除癌症、狂犬病等难治疾病外,最好不用.

3.2.6 双盲对比:主要用于临床研究,可减少医师和病人两方面的心理因素影响.实验中病人和观察病情的医师都不知道谁是用药组,谁是对照组.只有主持研究者保留名单,以决定具体治疗措施和分析实验结果.为新药临床研究中必不可少的方法之一.

二、药理实验设计中的剂量问题

1、安全剂量的探索:

首先用小鼠作急性毒性实验, 求出最大耐受量(或LD1). 然后按等效剂量的直接折算法计算出实验中所用动物的最大耐受量取其1/3－1/5作为较安全的试用量.

2、剂量递增方案:

对于非致死性毒性反应较明显的药物,可先采用较小的剂量(例如LD1的1/50)作预试,以策安全.试用后如未出现药效,也无任何不良反应,可将药物剂量递增.每次增幅由100％递减至30％左右,直至出现明显药效或产生明显不良反应.具体方案见下表:

剂量递增表:

The Increasing of dosage

实验次数(Experiment No) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

剂量倍数(Dosage Times)1 2 3.3 5 7 9 12 16 21 28 38 50

3、不同种属动物间的剂量换算:

对于文献中有在其它种属动物使用剂量的药物, 可通过剂量换算过渡到实验需用动物上来.以往常用的标准动物的等效剂量折算系数法,简便适用,但不宜用于体重不标准的动物.

不同种属标准体重动物整体(只)剂量折算倍数K

Times(K)of Dosage Conversion Between Various Standard Weight Animals

动物种属小鼠 大鼠 豚鼠 兔猫 猴 犬 人

Animal sortsmouserat cavy rabbitcat monkey dog human

小鼠mouse(20g)17.0 12.2527.8 29.764.0 124 388

大鼠rat(200g) 0.14 11.74 3.9 4.2 9.2 17.856.0

豚鼠cavy(400g) 0.08 0.57 12.25 2.4 5.2 9.2 31.5

兔rabbit(1.5kg) 0.04 0.25 0.44 1 1.082.4 4.5 14.2

猫cat(2.0kg) 0.03 0.23 0.41 0.92 1 2.2 4.1 13.0

猴monkey(4.0kg) 0.0160.11 0.19 0.42 0.4511.9 6.1

犬dog(12kg) 0.0080.06 0.10 0.22 0.230.52 1 3.1

人human(70kg) 0.0025 0.0180.0310.07 0.078 0.16 0.321

整体动物剂量(Dosage of a whole animal): DB ＝ DA×KB/KA

现介绍一种对任何体重动物都适用的“等效剂量直接折算法”:后面的表列出了不同动物的公斤体重剂量折算的有关系数和标准体重整体剂量折算倍数,供计算时使用.

不同种属动物单位体重(kg)剂量折算系数

动物种属小鼠 大鼠 豚鼠 兔 猫 猴 犬 人

剂量折算系数K 10.71 0.62 0.37 0.300.320.21 0.11

动物体型系数R 0.0590.09 0.0990.0930.082 0.111 0.1040.1

标准体重(kg)0.02 0.20.4 1.5 2 4 12 70

标准体重动物:DB ＝ DA×KB/KA

非标准体重动物: DB ＝ DA×RB/RA×(WA/WB)1/3

三、药理实验设计中的预试问题

在正式实验前应充分重视预实验的重要性,它可大大提高实验的效率,避免盲目性.通过预试应建立并改进实验方法、选择最佳实验对象、条件及指标.通过预试应对于干扰实验的因素有明确的了解.通过预试应尽可能提高实验的稳定性和灵敏性.

1、实验的稳定性及其选择

实验稳定性通常可用同一样本重复实验结果的变异系数CV表示:CV＝SD / X

实验变异系数小于0.05表示稳定性好, 大于0.2 则表示波动太大, 需改进实验方法.药理实验中可利用CV的测定选择适当的动物模型.

2、实验的灵敏性及其选择

用药剂量稍有变化,反应强度即出现明显差异,说明灵敏度较高.灵敏度可用因变系数C.C.表示:C.C.＝|(R1－R2)/(log D1－log D2)|

式中R1、R2为反应强度,D1、D2为相应的药物剂量.

药理实验中可利用CV和C.C.的测定选择最佳的实验动物、实验脏器或实验条件.

3、预试的任务及预试结果的意义

预试中应有计划地查明与保证正式实验成功有关的各种重要信息, 如: 动物品种、脏器类型、实验条件、实验方法、药物用量、观察指标等等.用于预试所得数据是在逐步改进的过程中陆续收集的,时间差异较大,一般不宜将预试结果并入正式实验结果.

通过预备实验,可拟出实验记录的内容,以保证正式实验能有条理、按顺序进行,不致遗漏重要的观察项目,便于对结果进行统计分析.实验记录一般包括以下内容

(1)实验标本的条件:如动物的种类、来源、体重、性别、编号等.

(2)实验药物的情况:如药物的来源、批号、剂型、浓度、剂量及给药途径等.

(3)实验的环境条件:如实验日期、时间、温度、湿度等.

(4)实验进度、步骤及方法的详细记录.

(5)观察指标的变化情况:包括原始记录和相关描记图纸或照片.

(6)资料整理、数据统计分析及其结果.

(7)实验中存在的问题、改进措施,需要进一步探讨的问题.

每次实验都必须随时记录,每一阶段结束时,都要对及时进行分析结果、整理数据,并画出必要的统计图表,作出结论,写出报告.

（1）分析题意可知：本实验为了研究胰岛素对提高细胞克隆形成率的作用，即探究胰岛素对动物细胞摄取葡萄糖和促进细胞增殖的作用，故该实验的自变量是有无胰岛素，因变量是葡萄糖浓度和细胞数目，另外实验设计要遵循等量性原则，单一变量原则，因此实验思路： ①取培养瓶若干个，分组如下： 甲组：动物细胞培养液+小鼠血管平滑肌细胞+（与生理盐水等量的一定浓度的）胰岛素溶液， 乙组：动物细胞培养液+小鼠血管平滑肌细胞+2ml生理盐水； （2）若胰岛素对上述变量均发挥效应，则实验后细胞数目增多，培养液的葡萄糖浓度下降．如下图：（3）分析与讨论 ①本实验为了研究胰岛素对提高细胞克隆形成率的作用，即探究胰岛素对动物细胞摄取葡萄糖和促进细胞增殖的作用，故该实验的自变量是有无胰岛素，因变量是葡萄糖浓度和细胞数目，故用葡萄糖浓度和细胞数目作为检测指标． ②实验中每组细胞培养瓶不止一个，可在显微镜下用血细胞计数板对细胞进行直接计数，为了减少误差需要统计数据求平均值． ③根据实验结果分析：胰岛素具有促进细胞摄取葡萄糖和细胞增殖的作用，因此添加适宜的胰岛素可以提高细胞克隆形成率． 故答案为： （1）胰岛素的有无 2ml生理盐水 （2）（3）①葡萄糖浓度，细胞数目 ②血细胞计数板统计数据求平均值 ③胰岛素具有促进细胞摄取葡萄糖和细胞增殖的作用

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