细胞周期测定实验有哪些，怎么做?

细胞计数法

实验方法原理： 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

实验步骤：

一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

三、取出盖片，按下列顺序操作：

PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

五、计算

分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

BrdU参入法

实验方法原理： 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

一、试剂配制

二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。

三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

五、常规染色体制片。

六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

七、弃去2×SSC液，流水冲洗。

八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

十、计算

细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

细胞周期 （cell cycle) 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。

1.间期

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

（1）G1期

此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

（2）S期

S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

（3）G2期

为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

2.分裂期

细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

（1）前期（prophase） 染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

（2）中期（metaphase） 细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46，XY，女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

（3）后期（anaphase） 由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。

（4）末期（telophase） 染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合

为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

在体内根据细胞的 分裂能力 可把它们分为三类：

①增殖细胞群 ，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环。

②不再增殖细胞群 ，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）。

③暂不增殖细胞群 ，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。

流式细胞仪

实验方法原理： 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。

实验步骤：

一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心15 min去上清。

二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹匀，务必吹散。

三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。

四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。

五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。

六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。

九、样品分析测定及打印。

常见问题

1.Q：胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？

A：以乳腺细胞的DNA含量测定为例，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.

2.PI分析细胞周期及凋亡率相关问题

Q： （1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？

A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q： （2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？

A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定。

Q： （3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。

Q： （4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。

3.Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？

A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI

  4度孵育30min”。至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。

4.Q：肿瘤细胞测周期。70％乙醇是否必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，PBS和乙醇配会出现絮状物？上流式前细胞用75％乙醇固定，使用瓶装75％乙醇是否可行？

A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

5.Q：流式分析细胞周期，收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？

A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：

（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机

（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿

（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

固定化细胞是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢等）的细胞。它是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，起源于20世纪70年代，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过各种方法将细胞和水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。1．5．1无载体的固定

无载体固定主要目的是将吸附或者共价交联的细胞，彼此分成自身独立

的区域。所谓吸附过程是指细胞发酵过程中产生的细胞体絮凝或者呈丸粒状；或

通过二级过程，在适应的参数变化之下，简单有效地制各出具有触媒活性的颗粒。

在此过程中。往往加入少量絮凝剂(即聚合物)，加入的聚合物可直接参与细胞间

的相互作用。其明显特征是颗粒牢固。

1．5．2预制载体的固定

在酶的固定化领域中，尤其是使用共价结合是一种典型的方法。这一方法也可

适用于固定化细胞的操作。触媒制备过程中形成的载体本体应不受物理、化学的

条件限制。因此载体物质的柔性与制作方法要求很高。在制作过程中最优化的机

械性能、孔隙结构受生理参数约束。

1．5．3载体制备过程中的固定

此法为整体细胞固定的一种通用方法。该工艺主要包括截留与密封。其实密封

是一种边际效应。此法的特点是：由于整个细胞大小，制成的网状体比较简单，它能全面封锁滞留细胞，并对输送基质与产品有足够快的高效酶活；由于制备载体与保留酶活性

及细胞存活生理要求条件适合，故载体制备的主要问题已得到解决。

1．5．4生物触媒内固定化细胞的生长

此法正因其日趋重要而引起人们的注意。其理由是：整个细胞体处于存活状态

下。制成生物触媒时，在小球之内，它的细胞浓度很可能增加和提高。新制各的

生物触媒或者一级与多级酶系统生物触媒，经再生利用都可能出现一定程度的失

活。而置入适当的生长环境下培养，其细胞浓度可能又会增加。最后，活细胞生

物触媒或在静止期、或在生长期，作为多酶系统或辅酶系统的提供者，而得到利

用。

微生物细胞的固定方法有主要有物理吸附法和包埋法两种。

1．物理吸附法

带电的微生物细胞和载体之间的静电相互作用，使细胞体吸附固定在硅藻土、木材、玻璃、陶瓷和塑料等载体上。如酵母细胞是带负电的，在固定时要选择带正电的载体。在PH4时，热带假丝酵母、酿酒酵母等在陶瓷表面上的吸附程度较大，载体表面的40~70%被细胞牢固吸附，不会被高流培养液冲掉。载体的性质也影响细胞与载体之间的相互作用，主要是载体的成分、表面电荷、表面积和PH的影响。所有的玻璃和陶瓷都是由不同比例的氧化硅、氧化镁等组成，如将玻璃等放在溶液中，在它的表面会发生离子交换，形成不再是铝、硅等的氧化物，而为相应的氢氧化物。载体表面的羟基可被微生物细胞表面的氨基或羧基所取代，在细胞与载体之间形成键。物理吸附法固定化活细胞的酶活性不受影响，但吸附过程相当复杂，吸附过程与微生物的性质、载体的特性及细胞与载体之间发生的相互作用有关，只有这些参数配合恰当时才能形成稳定的微生物细胞-载体复合物。

物理吸附法固定微生物细胞现已广泛用于废水处理工程——生物膜法，中国科学院微生物研究所应用自养菌和异养菌的混合菌，吸附于玻璃钢蜂窝填料繁殖成生物膜，用以处理含硫氰酸钠的腈纶废水。北京工业大学应用驯化的混合菌吸附于活性炭的大孔及其表面，用以处理印染废水等。

2．包埋法

将微生物细胞用物理的方法包埋在琼脂、海藻酸钠、明胶、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）等凝胶载体内，使微生物细胞固定化。一般的包埋成形法比较复杂、机械性能差、易磨损、不适于大批量生产。因而近年来一些学者又研究了一种制备珠型固定化细胞技术。

1）琼脂凝胶包埋法，称取4g琼脂或琼脂糖溶于50ml 0.2M pH7.0磷酸缓冲液中，加热溶解后，冷却到55℃左右，将细胞浓度为60%左右细菌悬浮液于40℃下保温，然后与琼脂溶液混合均匀。用注射器针头将热的混合液滴入冷的甲苯溶液，四氯乙烯溶液或液体石腊内，冷却形成2~3mm直径的小球。或将热琼脂-细菌混合液流加到搅拌下的500ml30℃的醋酸丁酯中，加完后继续搅拌3分钟，到混合物分散成小滴，迅速加入300ml冷的醋酸丁酯，再搅拌2~5分钟，倾去醋酸丁酯，抽滤干，用缓冲液洗至无醋丁酯味，即制成珠型固定化细胞，小珠约在1~3mm。使用前将球形固定化细胞放入消毒好营养液中30℃活化24小时后再用。

2）海藻酸钙凝胶包埋法 称取2g海藻酸钠，加30ml生理盐水于高压灭菌锅中加热溶解、冷却到40℃，取20ml与20ml细胞浓度为50%的细菌悬浮混合均匀，然后用注射器针头滴加到0.1M氯化钙或4%的氯化钡溶液中，边滴边摇，使其形成2mm直径球型小珠，然后用生理盐水洗涤。或将混合液流加到搅拌下的200~500ml醋酸丁酯中，当分散成小滴后，迅速加入5ml 0.1M的二氯化钙溶液,继续搅拌5~10分钟,自然沉降,倾去醋酸丁脂,再加入50ml 0.1M的二氯化钙溶液,浸泡1小时,进一步固化,然后用蒸馏水彻底洗涤,即得直径为1~3mm珠型固定化细胞。干后可保存于低温下，使用前需放入消毒好的营养液中30℃活化24小时后再用。由于磷酸盐会破坏凝胶的结构，因而在使用海藻酸钠固定细胞时尽量防止磷酸盐的加入。

3）明胶包埋法 称取6g明胶，加入50ml 0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，加热溶解后冷却至40℃，取20ml与20ml细胞浓度为60%的细菌悬液在40℃混合均匀，冷却凝固后切成1~2mm3方块，然后再加2.5%戊二醛，使包埋块悬浮在戊二醛溶液中，室温下轻轻搅拌4小时进行交联，滤去戊醛后，逐次用0.1M氯化钠和去离子水洗涤后即成。或者将明胶-菌体混合液流加到200ml 20℃搅拌下的醋酸丁酯溶液中，当分散成小珠后，迅速加入5ml 5%的戊二醛溶液，继续搅拌5~10分钟，倾去醋酸丁酯，水洗即得到珠型固定化细胞，再放入50ml的pH5.0的戊二醛溶液中浸泡30分钟，然后彻底洗涤，即获得直径1~3mm的球形小珠。使用前将其放入营养液中30℃活化24小时后再用。用戊二醛交联的明胶包埋法，可获得机械强度及工作稳定性较好的固定化细胞。

4）聚丙烯酰胺凝胶包埋法，引此法是较常用的一种包埋法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合形成三维网状结构的凝胶。常用的催化剂和加速剂是过硫酸铵和四甲乙二胺或三乙醇胺。

称取17.6g丙烯酰胺和1.2g N—N′—甲叉双丙烯酰胺溶于0.05M pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，取20ml与5g的湿菌泥混合均匀，加入50μl的40%过硫酸铵，混合均匀后流加到搅拌的豆油或液体石蜡中，搅拌分散成小滴，迅速加入250μl的四甲基乙二胺，小滴即很快聚合形成小珠，倾去流体，用水或缓冲液充分洗涤即可获得珠型固定化细胞。或将菌泥混合液加入1%过硫酸铵0.25ml和10%三乙醇胺4 ml，将上述混合液搅拌均匀，不要出现气泡，置于40℃恒温浴中30分钟左右，即形成聚内烯酰胺凝胶固定化细胞，在凝胶未干时切成2~3mm3小块，于50~60℃中干燥后保存。使用前将包埋好的固定化细胞放入消毒后的营养液中活化24小时再用。最常用的是包埋法。

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