qpcr数据分析及作图方法

qPCR数据处理方法为△△Ct法原理

【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。

1、先来了解一下什么是Ct值？

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

1、整理qPCR数据如下。Sample为模板名称，595为引物扩增的基因名称，actin为内参。

2、计算ΔCt。ΔCt=基因值-内参值。

3、计算均值。以野生型SY4D表达量为1，只需计算SY4D均值。

4、计算ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt-average。注意average是同一个，函数上加$。

5、计算2^(-ΔΔCt)。

6、计算2^(-ΔΔCt)均值。三个重复计算平均值即可，用于作图。

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途：

qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为 绝对定量 和 相对定量 。

好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。

qPCR和PCR一看名字就知道很像， q 就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌）

其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。

具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数， 如果你的样本中DNA1的量 大于 DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值.

如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。

在实际实验过程中， 我们的实验没那么简单

一个仿真例子：

那么我们一般这样做，我会有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞geneA表达量的差异，我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR， 获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间 RNA产量 ， RNA质量 以及 逆转录效率 上的差别。

最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法 （读作：delta delta CT）

公式如下

即 先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异 ，而我们的表达量的差异就可以表征为

虽然大多数qPCR设备都配有很完备的分析软件，

但是 。。。。。

这些软件的图可能不适合直接放文章，或者， 咳咳，很丑,你想自己修改之类的

而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。

于是乎

秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽 的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量

该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果CT和其他两个差别很大，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行）

在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V2.0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。

大家感受一下， 一键出图 的魅力，喜欢的同学记得点赞，转发哦, 获取链接在文末

获得相对表达量值之后呢，你可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦

文章直通车>>> origin科研作图

此工具如有任何问题或者你们有什么建议或者链接失效等情况，请于公众号“肖恩札记”留言

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