细胞sem拍照前未逐级脱水什么影响

“这里正是新春”。解不透，用我们这稚心来看，倒也难以将其归为续昨日的盛夏和欣春，还是一亇新的天地在显身？说不准，且只好即归为续昨日的盛况，又视作新生的序吧。

如我爱阳光下的热闹，我亦极其喜欢月光的。秋日的夜，月色倍加光明，千里一色，如乳汁般，月光下的万物静穆着，如天真恬静的处子一双多思的睛，俯着首，闪着明眸，一派水色的纯，有人喻为“秋波”的正是。

扫描电镜（SEM）一般用来观察组织细胞的表面形貌，我见过的SEM可以观察到微绒毛、伪足、正在死亡的细胞表面出现的穿孔等结构，可能还有更高级的吧。透射电镜（TEM）可以用来观察细胞内部的细胞器等超微结构。不过我猜想操作技术足够精细到将一个细胞剖开的话，SEM也是可以观察细胞内部的。

Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒

产品说明：

凋亡是一种程序性的细胞死亡，与细胞的坏死有生化和形态等方面的不同。磷酯酰 丝氨酸(phosphatidylserine, PS)是细胞膜的一种组成成分，在正常细胞主要分布在细胞膜内侧；细胞发生凋亡的早期，PS会外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。Annexin V 对PS有高度的亲和力，可以选择性结合和标记PS 。本试剂盒采用重组人Annexin V-EGFP融合蛋白，来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的PS，标识出凋亡细胞。由于坏死细胞和凋亡晚期细胞，其膜内侧的PS也可以被Annexin V结合，通常用另一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)进行双重染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡晚期的细胞。用Annexin V-EGFP和PI染色后，正常的活细胞不被Annexin V-EGFP和PI着色；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-EGFP着色，PI 染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-EGFP和PI着色。用流式细胞仪或荧光显微镜直接观察PS外翻这一细胞凋亡的重要特征，是一种快速简便的细胞凋亡经典检方法。

操作方法：

染色液的配制：

1) 取适量4x Annexin V结合液，用双蒸水稀释至1xAnnexin V结合液。后续工作均使用1x Annexin V结合液。

2) 将20 μl Annexin V-EGFP加入1 ml Annexin V结合缓冲液中，即配成10次测试的 Annexin V染色液。

3) 将5 μl PI加入5 ml Annexin V结合缓冲液中，即配成10次测试的PI染色液。

荧光显微照相操作方法：

1) 培养细胞用所需方法处理以诱导凋亡。应同时设置阴性对照。

2) 对贴壁生长细胞，离心收取培养液内的悬浮细胞，并用胰酶消化贴壁细胞，合并两部分细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用冰冷PBS洗涤细胞后， 1000g离心5 min，弃上清，加入100 μl Annexin V染色液轻轻重悬细胞。室温(20-25℃)放置，孵育10~15 min。再加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min

3) 完成孵育后，1000g离心5 min，弃上清，轻轻重悬细胞于50~100μl Annexin V结合缓冲液中；取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。

4) 荧光显微镜下，用蓝光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像。结合Annexin V-EGFP 的凋亡细胞的质膜将显示绿色光圈；膜结构不完整的坏死细胞和晚期凋亡细胞在整个核区被PI染成红色而质膜为Annexin V-EGFP阳性呈现为绿色光圈。

5) 培养于48孔板或96孔板内的贴壁细胞，也可进行原位染色。在凋亡诱导结束后，用冰冷PBS轻轻洗涤细胞，完全去除PBS，加入100 μl Annexin V染色液，室温孵育 10~15 min；吸除染色液，加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min。立即在倒置荧光显微镜下观察。

流式细胞分析操作方法：

1) 培养细胞用所需方法处理以诱导凋亡。应同时设置阴性对照。

2) 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用冰冷PBS洗涤细胞后，取5~10万重悬的细胞，1000g离心5 min，弃上清，加入100 μl Annexin V染色液轻轻重悬细胞。室温(20-25℃)放置，孵育10~15 min。

3) 再加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min。

4) 完成孵育后，立即进行流式细胞分析。采用488 nm双波长激发，测定~510 nm和>575 nm的发射，细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。

注意事项：

1) 该试剂盒只能检测活细胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检 测。如需对活细胞固定进行其它检测，可在本试剂盒标记完成后，用Annexin V结合缓冲液清洗细胞，再固定进行后续操作。

2) 细胞凋亡是一种持续变化的动态过程，选择合适的诱导时间对观察凋亡比较重要。

3) Annexin V和PI染色的活细胞应尽快检测。

4) 微生物污染的细胞样品或试剂可导致错误的观察结果。

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