如何配制mes缓冲液

如何配制mes缓冲液,第1张

配制方法:计算MES用量至终浓度 30mmol/L;称重,用 Tris碱溶液(饱和或不饱和,其浓度都没关系)调节pH至6.5;加水定量就可以了。

在化学上用,化学物品和溶剂(一般是水)配制成实验需要浓度的溶液的过程就叫做配制溶液。配制溶液前需要计算所需物品的多少并清理仪器。

配制溶液注意事项:

1、氢氧化钠为碱性化学物质,浓盐酸为酸性化学物质,注意不要溅到手上、身上、以免腐蚀,实验时最好戴上防护眼镜。一旦不慎将氢氧化钠溅到手上和身上,要用较多的水冲洗,再涂上硼酸溶液。称量时,使用烧杯放置。

2、要注意计算的准确性。

3、注意移液管的使用。

4、稀释浓硫酸是把酸沿器壁慢慢注入水中,用玻璃棒不断搅拌。

5、配好的溶液要及时装入试剂瓶中,盖好瓶塞并贴上标签(标签中应包括药品名称和溶液中溶质的质量分数(或摩尔分数)),放到相应的试剂柜中。

10mmol/L HEPES缓冲液配制方法如下:

准确称取HEPES 2.383g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存(用于加入细胞培养液中作缓冲剂时,培养液需要避光保存)。

Hepes缓冲液的用途:对细胞无毒性作用。是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

扩展资料

HEPES buffer缓冲溶液的配制方法:

一、500ml 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock solution的配制

119.15 g HEPES 溶解在400ml蒸馏水中,加0.5~1M 的NaOH水溶液调节至所需pH,然后用蒸馏水定容至500ml,于4摄氏度保存。

二、加少量盐的HEPES Buffer配方(500ml)

HEPES 6.5g、NaCl 8.0g、Na2HPO4.7H2O 0.198g、用0.5M NaOH 水溶液调节pH值,最后定容。

注:HEPES的有效pH范围是6.8~8.2。

参考资料来源:百度百科-HEPES

第一向等电聚焦 ⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含IPG buffer)一小管(1ml/管),置室温溶解。 ⒉ 在小管中加入0.01g DTT, 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer,充分混匀。 ⒊ 从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品(考马斯亮蓝染色需样品1mg,银染需300μg),充分混匀。 ⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条,室温中放置10分钟。 ⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 ⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 ⒎ 分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。 ⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 ⒐ 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。 ⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。第二向SDS-PAGE电泳 ⒈ 装配灌胶模具,配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液,每块凝胶50ml,将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入,直至溶液到距离玻璃板1cm停止,用75%乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟后,凝胶与上方液体分层,表明凝胶已基本聚合,建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。 ⒉ 待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。 ⒊ 从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其恢复至室温。 ⒋ 配制胶条平衡缓冲液I(含DTT)。 5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 ⒍ 将胶条转移至平衡管或溶胀盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 ⒎ 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ(含碘乙酰胺)。 ⒏ 第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 ⒐ 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。 ⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。 ⒒将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 ⒓第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。 ⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 ⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 ⒖用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。 ⒗放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 ⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 ⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低功率(1W/gel/18-24cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(13-15W/gel/18-24cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 ⒚电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。 ⒛进行染色。


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