共聚焦显微镜为什么荧光能看见拍不出来

光束照耀的不对。共聚焦显微镜荧光能看见拍不出来是因为光束照耀的不对，共聚焦显微镜是一种扫描成像技术，通过与其他扫描技术（如扫描电子显微镜SEM）进行比较，可以xxx地解释所获得的分辨率。CLSM的优点是，例如在AFM或STM中，不需要将探针从表面上悬垂纳米级，例如，通过在表面上用细小尖端进行扫描即可获得图像。

拉曼光谱在最近这些年发展是比较快的，应该来说是受益于两方面吧。

一方面是激光技术的发展，我最近参加了在英国伦敦召开的第21届国际拉曼光谱大会，感受到现在基于超快激光的非线性拉曼光谱技术已经越来越成熟了。这种高精尖和需要昂贵设备的技术，原来仅有很少几个单位可以搞。特别是激光部分都是靠自己搭建，每天还得调，很不稳定，现在这个状况已经不存在了，而且仪器的价格相对也比较低。现在国际上推出的从事非线性光谱研究的超快(飞秒或皮秒)激光器，技术上已经达到比较成熟地步，可以成套购买，也较稳定。非线性拉曼光谱技术已经在生命科学领域研究中发挥它的独特和重要作用。例如，美国哈佛大学的谢晓亮教授在开拓并运用相干反斯托克斯拉曼光谱显微学（CARS Microscopy）研究活细胞内部三维结构方面取得一系列重要成果。我觉得高质量的超快激光器还推动了另一个极具前途的表面光谱技术，就是合频（SFG）技术的发展，它作为具有独特的界面选择性的非线性光谱方法，已经在界面和表面科学、材料乃至生命领域研究中发挥着越来越重要的作用。 近两年，实现拉曼与其它多种微区分析测试仪器的联用，其中有：拉曼与扫描电镜联用(Raman—SEM)；拉曼与原子力显微镜/近场光学显微镜联用(Raman—AFM/NSOM)；拉曼与红外联用(Raman—iR)；拉曼与激光扫描共聚焦显微镜联用(Raman— CLSM)，这些联用的着眼点是微区的原位检测。通过联用可以获得更多的信息，并提高可靠度。

钙钛矿太阳能电池是目前光伏及材料研究领域的宠儿。从最开始的比拼光电转换效率，到优化材料配方和形貌，到对更深层次的机理研究，几乎每月都有Nature 或Science 出现，大家已经习以为常。研究的热度高，也代表着竞争激烈，有人戏称现在能想到的常规及非常规idea和套路几乎都被做完了。

那么是否还有机会发顶级文章呢？当然有，前提是脑洞够大、眼光够“毒”。

今天介绍的Nature文章，来自光伏领域的大佬——瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Michael Grätzel教授的研究团队，他们研究了光照对金属卤化物钙钛矿薄膜形成的影响。这个切入点看似稀松平常，可以说该领域的研究者几乎人人都会遇到，但貌似只有他们注意到并进行了深入研究。

Amita Ummadisingu（本文一作，左）和Michael Grätzel教授（右）。图片来源：EPFL

在金属卤化物钙钛矿太阳能电池中，钙钛矿薄膜的质量会直接影响到器件的性能，优化钙钛矿薄膜的形貌显得非常重要。为了提高钙钛矿太阳能电池的性能，科学家们已经开发了许多器件结构及制备工艺，其中包括一步沉积法、顺序沉积法、反溶剂（anti-solvent）法。早期的研究已经发现制备钙钛矿的反应条件会对薄膜质量产生影响，比如反应物浓度以及反应温度。但是，科学家们对控制薄膜质量的精确反应机理以及主要因素的理解还称不上透彻。近日，Michael Grätzel教授研究团队以“光照”为切入点，利用共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）以及扫描电子显微镜（SEM）研究了两种常用的钙钛矿制备方法：顺序沉积法和反溶剂法，展示了光照对于钙钛矿生长速率以及薄膜形貌的影响，并对背后的机理进行了深入的研究。

工作介绍视频。视频来源：EPFL

首先，作者研究了光照对于顺序沉积法中钙钛矿形成的影响。在黑暗及光照条件下中，碘化铅（PbI2）沉积在介孔TiO2上，之后浸入甲基碘化铵（CH3NH3I，MAI）溶液中反应形成甲胺铅碘钙钛矿（CH3NH3PbI3）。在黑暗条件下，刚刚旋涂的PbI2薄膜没有展现出明显的结晶特点（图1a）。已有研究表明，结晶的金属卤化物与无定形组分相比，会展现出更强的发光。在浸入MAI溶液6秒后，就能看到明显的PbI2发光点（图1b，用绿色表示），结合SEM图像，可以证明已经形成了PbI2晶体。当浸渍时间增加到8秒时，他们在结晶PbI2簇的中央位置检测到了少量的钙钛矿（图1c，用红色表示），这表明在PbI2结晶之后MAI进入PbI2晶体开始反应生成钙钛矿。随后的结构识别发现了PbI2–钙钛矿混合晶体，这种之前并未见诸报道的现象也证明了PbI2结晶要早于钙钛矿形成。随着浸渍时间的延长，这种插入反应更加明显（图1d/1e）。而在1 Sun光照下，整个反应过程出现了两个明显的差异：光照下钙钛矿的形成更快，形成的晶体更小更多（图1f-1i）。作者还设计实验排除了伴随光照的加热效应对反应的影响，确认上述现象的诱因只有光照。

图1. 顺序沉积法，黑暗及1 Sun光照下制备甲胺铅碘钙钛矿的CLSM及SEM图像（内嵌）。图片来源：Nature

黑暗条件下，随着浸渍时间的延长，晶体的数量并没有随之增加（图1b-1d），这说明晶体成核在最初浸入MAI溶液的几秒内就已经完成，而且随后不会有新核产生。接下来，作者对不同光强下的成核进行了研究。浸渍25秒的样品，黑暗下、0.001 Sun、0.01 Sun、0.1 Sun以及1 Sun下的SEM图片（图2a）表明，尽管在黑暗条件下成核密度很低，但是一经光照，成核密度会呈指数型增加，证实了存在光诱导成核的现象。随后作者继续深入研究了光照影响PbI2膜成核过程的机理，在此不再赘述。

图2. 不同光照下的成核研究。图片来源：Nature

现在已经确定，顺序沉积法中进行光照能够让钙钛矿形成更快而且晶体更小更多，这对太阳能电池来说是好是坏呢？作者们在黑暗条件以及1 Sun条件下制备了光伏器件，黑暗条件下的器件平均光电转换效率（PCE）为5.9%，而1 Sun条件下的平均PCE为12.4%（最高可达13.7%），是黑暗条件下的两倍多。究其原因，可能是因为更小的晶体带来了更好、更均匀的表面覆盖，使得对入射光的吸收更佳，光电流密度更高。

研究完顺序沉积法，作者们继续研究另一种常用方法反溶剂法。该方法中，混合前体溶液（含金属和有机卤化物）被旋涂于基底上，随即滴加反溶剂（钙钛矿在该溶剂中不溶解）帮助钙钛矿形成，最后加热形成产品。有意思的是，光照在此种方法中起到的作用与在顺序沉积法中的正好相反，黑暗条件下用反溶剂法制备的CH3NH3PbI3太阳能电池平均PCE为16.9%（最高可达18.4%），高于1 Sun条件下的平均PCE 13.9%。作者们分析了原因，反溶剂法中，与黑暗条件相比光照下形成的钙钛矿晶体更小数量更多（图3），这与顺序沉积法类似。但是，由于黑暗与光照条件下反溶剂法制备的钙钛矿薄膜的表面覆盖都很好，而光照条件下形成的更多晶体在薄膜中引入了更多的晶界，这损害了太阳能电池的性能。

图3. 反溶剂法中黑暗及光照条件下的钙钛矿薄膜。图片来源：Nature

总而言之，作者通过实验证实黑暗条件对于反溶剂法制备钙钛矿薄膜是有利的，然而对于顺序沉积法来说情况相反，有利的条件变成了光照。这个结论看似简单但却非常重要，再结合对现象背后机理的深入研究，对于控制钙钛矿薄膜的形貌以及高质量钙钛矿太阳能电池的大规模生产都具有指导意义。

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