冷冻干燥保藏法的步骤

（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6-7.5mm，长105mm，球部直径9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm，121.3℃灭菌30分钟，备用。

（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7-10天。

（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。

（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。

（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。

抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6-8小时即可。

（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

取样，戊二醛等固定液固定，酒精梯度脱水，冷冻干燥or二氧化碳临界点干燥，喷金或蒸碳。

以上四个步骤，根据所使用的SEM成像的真空模式，可以有所省略。

如果用ESEM，取样后可直接放入样品室，在一定“环境真空”下进行观察；如果采用LV模式，直到干燥，可以免喷金；高真空模式，必须做到喷金等样品导电处理。

具体可到公益网站：中山大学生物电子显微学实验室网站查询

扫描电镜样品制备: 基础课程，生物样品因含水，其样品制备有其特殊性。

http://bioem.sysu.edu.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5

有时候公益网站有点那个，不好点开，请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/

保存菌种的方法，应根据菌种的类型和保存目的进行选择，一般包括以下几种方法：

1、培养基保存法：此法不需要特殊设备，并可随时提供使用，为常用的一种保存方法，其缺点是易发生变异。营养要求

不高的细菌，可用半固体保存法，一般2～3月转种1次，并检查菌株特性，如特性已改变，则需丢弃。特殊培养要求的细菌，如流感嗜血杆菌可接种巧克力琼脂斜面，密封后冰箱贮存，每2周转种1次。淋病奈瑟菌保存于巧克力琼脂，每天或隔天转种1 次，不宜4 ℃冰箱保存，因易死亡。

2、快速冷冻法：将纯培养细菌在液体培养基上增菌后，取数个新鲜菌落加入含小牛血清或脱纤维绵羊血的培养基内制成浓菌悬液，再放人无菌玻璃珠，将此瓶放入－30℃以下低温冰箱保存。需要时用无菌镊子取出1 粒玻璃珠置增菌培养液中，增菌培养后即可获得新鲜菌种。用此方法，大部分细菌可保存6 ～12 月，甚至更长时间。

3、冷冻干燥法：是菌种保存最佳方法，可以免去细菌因频繁传代而造成菌种污染、变异和死亡。此法需冷冻干燥设备，操作较费时，但适用于需要长期保存的菌种。

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