谁知道原位杂交怎么做？

原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。

我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。

原位杂交（In situ hybridazation）

固定

收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)

斑马鱼因其基因与人类基因的相似度达到87%，且早期胚胎透明、发育速度快、便于体外观察，成为生物学的模式生物之一。为了解酒精对人胚胎发育的影响，研究人员利用斑马鱼开展了相关研究：

步骤1：用同一对斑马鱼的受精卵，发育24小时，选取50枚发育正常的胚胎。

步骤2：使用斑马鱼胚胎培养用水稀释无水酒精，获得浓度为0.01%、0.1%、1%、10%的酒精溶液。

步骤3：将斑马鱼胚胎各10枚，分别置入不同浓度的酒精溶液和斑马鱼胚胎培养用水中。在受精卵发育72小时时，观察胚胎存活和循环系统发育情况，记录如下：

组别

①

②

③

④

⑤

酒精浓度

斑马鱼胚胎

培养用水（0%）

0.01%

0.1%

1%

10%

死亡率（%）

0

0

0

9.4

100

循环系统畸形率（%）

0

0

9.4

88

/

分析回答下列问题：

（1）实验材料的选取直接关系到实验成败。利用斑马鱼进行人胚胎发育相关研究的原因是______。

（2）该实验中①组起______作用。在不同浓度的酒精溶液中放入斑马鱼胚胎10枚而不是1枚，目的是避免实验的______。

（3）由以上数据可得出的结论是______。

（4）怀孕期间孕妇饮入的部分酒精会通过______、脐带从母体进入胎儿，对胚胎发育造成影响。

---