qPCR扩增曲线的自述

大家好！首先跟大家做一个自我介绍：

我是扩增曲线，来自荧光定量PCR，是用于描述qPCR动态进程的曲线，我有两种形态，一种是线性图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值；另一种是对数图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值的对数。大家根据我来确定Cq值，最终确定初始模板的含量。新冠疫情以来，我可是发挥了重要的作用，诊断技术的金标准，骄傲的很呢。

在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下，PCR扩增产物理论上是呈2的倍数增长的，所以我应该是长这个样子的：

但是呢，理想很美好，现实却很骨感，随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭等诸多因素影响了PCR扩增效率，实际的我是长这样的：

不过S型的曲线，曼妙的身材，我还是很满意的。

大家也根据我将PCR进程分为4个时期，分别为基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。我的特征还是很明显的：基线期平整；指数期起峰，陡度较大；线性期慢慢趋于平整；平台期基本平整。

如果大家在每次实验中都能遇到如此美丽的我，那就是“你好我好大家好”的欢快场景了。但是在实验过程中，大家可能会看到各种奇形怪状的我，分析不出原因，导致实验止步不前，因此茶饭不思，郁郁寡欢。

其实主要还是大家对我不太了解。我，作为大家的科研小助手，单纯善良，心思简单，没有那么多套路的。之所以出现奇奇怪怪的我，都是有原因的。接下来可都是满满的干货吆！笔记要做起来了吆！

一． 没有Cq值出现

1. 反应循环数不够：一般设定在35个循环以上，也可根据实验情况增加循环数。

2. 引物/探针设计不当或发生降解：优化引物/探针的设计；或通过PAGE电泳检测其完整性。

3. 模板浓度低或降解导致：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；同时样品制备时尽量避免引入杂质和反复冻融。

二．Cq值偏大

1. 模板浓度低：建议提高样本的上样量。

2. 扩增效率低：反应条件不适宜或引物探针设计不当，建议通过绘制标准曲线确认扩增效率，同时对反应条件和引物探针设计进行优化。

3. PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。如果扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物。

4. 反应体系中可能有PCR反应抑制物：建议将模板梯度稀释后加入反应体系，或者重新制备纯度更高的模板。

三．扩增曲线末尾起跳，但没有完整扩增

1. 可能存在污染：建议对样本进行复检。

2. 如果是阴性对照，可能是引物二聚体或污染导致；如果是正常样本，说明浓度过低或者加样量不足。

四．复孔重复性差

1. 加样误差导致：定期校准移液器；同时可先配制除模板以外的其他试剂的预混液，然后进行分装再加入模板，其次加大模板上样体积，以上均可降低移液误差的影响。

2. 模板浓度越低，重复性越差。建议提高模板量，使Ct值在15-30之间。

现在大家对我的了解是不是又多了一些呢？是不是对qPCR实验又充满了信心呢？Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，没有他就没有我那么多标致的图片，感受它的魅力呀！

实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团（探针或染料），利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过Cq或Ct值和标准曲线对起始模板进行绝对定量或相对定量分析。而评估荧光定量PCR反应效果好坏，可以从以下几个方面来评估：

1.扩增效率及相关系数

良好的PCR扩增是指数级的，理论上以100%的效率进行，但实际上并不是所有的PCR反应都表现出相同的高效率，所以需要验证实际的扩增效率E。当计算评估PCR扩增效率时，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，得到线性方程Cq= -klgX0+b、扩增效率E=10(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之间，即扩增效率在90-110%，被认为此扩增接近理想情况；相关系数R2值大于0.98时，说明两个数值之间相关的可信度很好，可用来计算。

2.精确度（Precision）

指多个复孔Cq值之间的接近程度，且重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。

3. 重现性（Reproducibility）

指不同批次之间或不同实验室之间的结果变化，通常通过SD或者CV来评估。

4. 灵敏度（Sensitivity）

通常灵敏度表示为检测限(limit of detection, LOD)，可通过梯度稀释样品来确定最低检测限。分析灵敏度是指一个样本可通过实验精确测量的最小拷贝数。

5. 准确度（Accuracy）

指测量值与真实值的接近程度。针对低拷贝样本，由于受采样概率的影响，可能会导致结果不准确。为了更可靠地检测低拷贝，可以增大平行实验的重复数，来统计显著性。

6. 特异性（Specificity）

指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。

通过这六个方面就可以评估实时荧光定量PCR反应效果。你学会了吗？

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