α-磷酸锆在电化学葡萄糖传感器中的应用

生物传感器作为一种新型的检测技术具有体积小，成本低，准确、灵敏、易操作，又不会或很少损伤样品或造成污染，可现场检测等优点，因此国内外对生物传感器展开了广泛深入的研究，且纳米材料在生物传感器中的应用也已经进入新的研究阶段。这是因为纳米材料的量子尺寸效应和表面效应可以有效地提高生物传感器的响应性能。

将α-ZrP层状材料进行剥离，剥离的α-ZrP比表面积大、表面活性中心多．以其作为插层主体，将葡萄糖氧化酶(GOx)引入到α-ZrP层间，制成了电化学葡萄糖传感器并将其应用于葡萄糖的检测中。由于α-ZrP层状材料具有良好的导电性，从而提高了生物传感器的灵敏度、稳定性及抗干扰能力。

一、实验部分

1、仪器和试剂

α-ZrP（from绵竹耀隆化工）、B-D-葡萄糖、葡萄糖氧化酶(GOx，196000unit／g)、四丁基氢氧化铵(TBAOH)、壳聚糖和二茂铁甲酸(FcCOOH)。配制三种不同的磷酸盐缓冲溶液（二茂铁甲酸）：

(1)10 mmol/L PBS，pH7.0；

(2)10 mmol/L PBS，pH7.0, 1mmollL Ca2+)；

(3)10 mm01/L PBS，pH7.0，1 mmol／L

实验中所用的其它试剂均为分析纯。所用水均为二次蒸馏水。所有实验均在室温下进行。

循环伏安法、差示脉冲伏安法和计时电流法均在CHI 760B型电化学工作站上室温下进行。计时电流法时，支持电解质的体积为10 mL。电化学实验采用三电极体系，修饰的玻碳(GCE，直径4 mm)电极为工作电极，Ag／AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。利用DOmax 2500 X—ray粉末衍射仪对样品的结构进行分析。利用JSM一5600LV显微镜进行扫描电子显微镜(SEM)分析。

2、α-ZrP的剥离和葡萄糖氧化酶的固定

首先配置2％α-ZrP的悬浊液。即将0.2g α-ZrP溶解在10 mL的二次蒸馏水中，然后加入适量的TBAOH。这样得到的悬浊液在室温下搅拌12h使α-ZrP剥离，再置于超声仪中超声40min，从而加快α-ZrP的剥离并使其能充分分散，将制得的2％α-ZrP的悬浊液和2.3 mg／mL COx溶液按照3：1的体积比进行混合．在室温下放置1 h使其达到平衡状态。反应完毕后反应液在10 000 r／min的转速下离心10 min。使游离的葡萄糖氧化酶与已经同定的葡萄糖氧化酶分离。再用二次蒸馏水进行清洗。最后将所制备的GOx／α-ZrP冻干。干燥之后可以发现。没有和GOx发生反应前，α-ZrP的粉末是白色的。当进行完以上反应过程后。得到的GOx／α-ZrP粉末变成了黄色，证明了GOx／α-ZrP的成功合成。

3、葡萄糖传感器的制备

在使用玻碳电极前，分别用1和0.05um的铝粉打磨电极，直到获得光滑的玻碳电极镜面为止。然后冲洗干净，再分别用二次蒸馏水、乙醇溶液和二次蒸馏水超声1 min。将由上面过程制得的干燥的GOx／α-ZrP粉末取1 mg溶解分散到0.5 mL二次蒸馏水中，然后取6uL的混合液滴在经过预处理的玻碳电极的表面，干燥后，再滴6uL 0.3％的壳聚糖溶液．再置于4℃冰箱中过夜自然干燥即可得到所需的生物传感器界面。在不使用时，将修饰有GOx／α-ZrP的电极置于4℃冰箱中干燥保存。

二、结果与讨论

1、α-ZrP和Gox/α-ZrP的表征

XRD作为研究晶体结构的一种重要手段。被广泛用来表征无机纳米材料。图1是GOx／α-ZrP的XRD衍射图。GOx／α-ZrP层间距的测量按Bragg定律进行计算。根据Bragg定律(从00l反射(Z=1,2, etc．))由此可以算出d=11.6 nm，即葡萄糖氧化酶的介入，使α-ZrP的层间距增大，同时可以表明葡萄糖氧化酶已经进入到α-ZrP的夹层当中。

图2是制备的GOx／α-ZrP层状材料的扫描电镜图。图2(a)为制备GOx／α-ZrP的低倍扫描电镜图。从图中可以看到制备的GOx／α-ZrP的大致形态。其薄膜表面致密并且比较均匀，这表明了GOx／α-ZrP膜的形成及其形成的层层组装的方式比较一致。图2(b)为GOr/α-ZrP的高倍扫描电镜图，从图中可以看到，层片状的GOx／α-ZrP，较均匀的排列，粒径较小，分层形成小的聚合体。

2、GOx／α-ZrP修饰电极的电化学行为

图3中曲线a是在0.1 mol／L磷酸盐缓冲溶液中(pH7.0)GOx／α-ZrP修饰电极的循环伏安曲线图。从图中可以看出GOx/α-ZrP修饰电极的循环伏安曲线没有明显的氧化还原峰，当往磷酸盐缓冲液中加入1 mmol／L二茂铁甲酸后出现一对很明显的氧化还原峰(曲线b)，但当继续加入1mmol／L葡萄糖时。其循环伏安曲线发生了明显的变化(曲线C)，氧化峰电流明显增大，而还原峰电流减小。这说明葡萄糖在GOx的催化作用下，发生氧化反应．使氧化还原曲线发生显著的变化。在该过程中。二茂铁甲酸只是媒介体，起着传导电子的作用．其氧化还原反应的反应机理：

在没有加人葡萄糖(曲线b)的情况下，加入二茂铁甲酸，只会发生(3)反应，(1)和(2)不发生，所以得到的是可逆的循环伏安曲线；但当在GOx存在．同时二茂铁甲酸也存在的条件下。加入葡萄糖(图3曲线c)，(1)和(2)反应与(3)同时发生，由于(1)和(2)反应中发生的是得电子的过程，这与(3)中FcCOOH(ox)→FcCOOH(red)的半反应的得电子过程相竞争，使得还原峰电流减小；同时在整个反应中生成的FcCOOH red)增多，从而使得(3)的FcCOOH (red)→FcCOOH(ox)的半反应失电子增多，氧化峰电流增大。因此便得到了图3中的曲线C的氧化还原曲线图。

在固定葡萄糖的浓度为2 mmol／L的情况下，考察了不同浓度的二茂铁甲酸对GOx/α-ZrP膜修饰电极电化学行为的影响。图4是GOx/α-ZrP膜修饰的玻碳电极在10 mmol／L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中加入不同浓度的二茂铁甲(浓度范围0.1～50 umol／L)的差示脉冲伏安响应曲线。从图4可以看出。随着二茂铁甲酸浓度的增大，其电流响应也随之增大，且峰位置保持不变。由此可以得出．二茂铁甲酸的浓度对GOx／α-ZrP膜修饰电极对葡萄糖的响应值有很大的影响。二茂铁甲酸的浓度越高。其响应值也就越大。由此可见，二茂铁甲酸的浓度影响了GOx／α-ZrP膜修饰电极的信号强度，同时也直接影响了传感器的检测下限．另外二茂铁甲酸的浓度与电流响应值之间存在正比例关系。综合以上结论可以得出高浓度的二茂铁甲酸对该实验是有利的。但由于二茂铁甲酸在中性条件下溶解度不高．整个实验过程采用二茂铁甲酸的浓度为1 mmol／L。

3、生物传感器的响应特性及葡萄糖的检测

图5是GO/α-ZrP膜修饰的玻碳电极对葡萄糖催化的循环伏安曲线图。从图中可以看到，当加入不同浓度的葡萄糖时。其氧化峰电流随葡萄糖浓度的增大而增大。而还原峰电流则随葡萄糖浓度的增加而不断减小氧化峰。并且氧化峰和还原峰的峰位置都不变，这是典型的电催化峰形特性。这表明了GO/α-ZrP膜修饰的玻碳电极在二茂铁甲酸存在的条件下对葡萄糖有很高的电催化活性。

图6A是GO/α-ZrP膜修饰的电极对葡萄糖响应的计时电流图，图6 B为葡萄糖传感器的标准曲线。从图中可以看到．该传感器对葡萄糖有灵敏快速的响应。在0.0l～20 mmol／L范同传感器呈良好的线性关系，相关系数为0.996，根据S/N=3的原则．可以得出检测下限为0.01mmol／L。由于传感器的线性范围覆盖了4个数量级．这表明了有大量的酶分子固定到电极表面。另外传感器对葡萄糖的灵敏度为4.74 uA／(mmol/L)。

三、结论

将α-ZrP进行剥离，通过α-ZrP与葡萄糖氧化酶的自组装，在α-ZrP层间成功地插入了葡萄糖氧化酶，再将该复合物同定到玻碳电极的表面，这样制得了的电化学葡萄糖传感器在用二茂铁甲酸作电子媒介体时对葡萄糖响应迅速，并有较宽的线性范围和较高的灵敏度。

从目前国内外葡萄糖传感器的发展现状来看，葡萄糖传感器要进入实用化临床应用还存在许多困难，除灵敏度低、稳定性差、寿命短外，线性范围低也是一个难以解决的问题。一般葡萄糖传感器的线性范围只有几个mM，而糖尿病患者的血糖浓度可达33.3 mM。目前要解决这一问题主要是在酶膜表面覆盖一层具有选择透过性的高分子薄膜作为扩散限制膜，其目的在于扩大葡萄糖传感器的响应线性范围；减少电话性物质的干扰。 为什么引入扩散限制膜能扩大葡萄糖传感器的响应线性范围？根据葡萄糖氧化酶对葡萄糖的响应动力学，只有在较低的葡萄糖浓度范围内，葡萄糖氧化酶对葡萄糖浓度的响应才是线性响应。扩散限制膜的一个作用是使血液中的葡萄糖分子扩散透过这层具有选择透过性的高分子薄膜到达葡萄糖氧化酶膜表面，从而降低葡萄糖分子的扩散速度，使葡萄糖分子的扩散过程作为整个反应的控制过程，酶膜中的葡萄糖浓度始终保持在较低的浓度范围内，达到扩大线性范围的目的。扩散限制膜的另一个作用就是阻止或减少血液中诸如抗坏血酸等电活性物质到达葡萄糖氧化酶膜表面，干扰葡萄糖传感器的测量，虽然葡萄糖氧化酶对葡萄糖是特异的，但这种特异性被电极的不良选择所降低，在 650mV电压下，不但过氧化氢有响应电流，而且血液中抗坏血酸也有响应电流[1]，这些电活性物质通过电极的氧化或与过氧化氢发生反应而干扰传感器的功能[2]。 扩散限制膜可以减少电极对酶动力学的依靠性，而且还可以减少过氧化氢的生成[3]。扩散限制膜可以减少葡萄糖传感器对氧气压力的依靠性[4]。扩散限制膜材料的选择应是对葡萄糖扩散起限制作用。另外，要求扩散限制膜材料对葡萄糖氧化酶的影响和在生理条件下对电极的侵蚀尽可能的小。扩散限制膜材料的选择也必须满足无毒、生物相容性好，耐受性高、化学稳定性高（在生理条件下）等条件。目前国内外所选用的扩散限制膜材料有醋酸纤维素（CA）[5]、聚氨酯（PU）[6]、聚氯乙烯（PVC）[7]、聚碳酸酯（PC）[8]、Nafion[9]以及聚四氟乙烯（PTFE）[10]等。由于PU生物相容性好，有良好的成膜性能，适合作为扩散限制膜。为此，进行了PU扩散限制膜的研究。 1．实验部分 1.1．实验仪器与药品 葡萄糖氧化酶（GOD，EC 1.1.3.4）为Sigma化学公司生产，戊二醛为成都美乐医疗保健品有限公司进口分装，聚氨酯为本校高分子材料系合成，微电流计为中科院感光化学所设计。其余药品均为分析纯。 1.2．葡萄糖传感器的制备 葡萄糖氧化酶的固定以壳聚糖为固定基质，采用交联法固定葡萄糖氧化酶。配制壳聚糖（3%，，W/V，去乙酰度83%，溶于冰醋酸中）溶液。移取25μl GOD溶液（5mg/ml）加入5ml的烧杯中，用铂丝以一个方向搅拌，缓慢加入2ml壳聚糖溶液并不断用铂丝搅拌，缓缓加入100μl戊二醛（1%，V/V），以戊二醛加完开始计时，铂丝浸泡8-10 min，取出干燥后浸入聚氨酯溶液（聚氨酯溶于四氢呋喃：N,N-二甲基甲酰胺=9:1的溶剂中）中2a左右迅速取出在空气中静置5 min，然后放入磷酸缓冲溶液（pH=6.8）中，在4℃的冰箱中保存备用。外层扩散限制膜的厚度通过不同浸渍次数和不同聚氨酯溶液浓度来控制。 1.3．葡萄糖传感器响应测试 测试条件为pH=6.8，温度t=37℃，工作电压=0.7V。参比电极为Ag/AgCl电极，在测试前葡萄糖传感器磷酸缓冲液中稳定2h以获得稳定的背底电流。葡萄糖溶液配制好后放置过夜以产生旋光性。 2．结果与讨论 不同聚氨酯浓度及不同浸渍次数条件下的葡萄糖传感器对葡萄糖的响应曲线如图所示。图1为聚氨酯浓度为5%（W/V）浸渍不同次数的葡萄糖传感器的响应曲线图。由图可以看出，随着浸渍次数的增加，响应的线性范围逐渐增加，浸渍4次的响应线性范围达到16.7mM，而响应电流随着浸渍次数的增加而下降。 图2为聚氨酯浓度为6.5%（W/V）浸渍不同次数的葡萄糖传感器的响应曲线图。由图可以看出，随着浸渍次数的增加，响应线性范围逐渐增加，浸渍4次的响应线性范围达到22.2mM，而响应电流随着浸渍次数的增加而下降。 图3为聚氨酯浓度为8%（W/V）浸渍不同次数的葡萄糖传感器的响应曲线图。由图可以看出，随着浸渍次数的增加，响应线性范围逐渐增加，浸渍4次的响应线性范围达27.8mM，响应电流随浸渍次数的增加而下降。图4为聚氨酯浓度为10%（W/V）浸渍不同次数的葡萄糖传感器的响应曲线图。由图可以看出，随着浸渍次数的增加，响应线性范围逐渐增加，浸渍4次的响应线性范围达33.3mM，响应电流随浸渍次数的增加而下降。对同一浸渍次数的葡萄糖传感器，随着聚氨酯浓度的增加，响应线性范围逐渐增加。

安培。

灵敏度单位的意思是安培每毫摩尔浓度每平方厘米。安培直接取峰电流，除以葡萄糖的浓度，再除以电极的表面积，即可。

葡萄糖传感器，用含有葡萄糖氧化酶的膜作感受器，氧电极作换能器构成的传感器。

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