2.冰冻切片8-10μm，推荐瑞沃德冷冻切片机，温度稳定，切片质量高。室温放置30分钟以上防脱片，-20℃保存。从冰箱拿出的冰冻切片在室温放置30分钟以上再进行免疫荧光。
3.1xPBS洗3次，每次3-5分钟。
4.用2%BSA室温或37℃封闭1小时。
5.一抗4℃孵育过夜。1xPBS洗3次，每次3-5分钟。
6.二抗室温或37℃，避光孵育1小时。1xPBS洗3次，每次3-5分钟。
7.DAPI染色。1xPBS洗3次，每次3-5分钟。
8.滴加防淬灭剂，封片。
一、样品处理
1.1 Q：包埋过程应遵从什么原则？
A：
(1) 选取的组织要大小合适，便于后续实验操作。
(2) 取的组织要尽量新鲜，避免RNA降解。
(3) 选用合适的包埋盒，包埋盒不能过小，避免在包埋过程中，包埋剂膨胀会挤压组织。
(4) 包埋过程中避免包埋剂分层，防止组织表面形成小冰块，避免气泡的形成，影响后续切片实验。
1.2 Q：切片染色拍照后发现组织中间有空洞，是怎么回事？
A：包埋过程中如有挤压情况发生，可能会导致组织出现形态变化，发生空洞现象，建议包埋过程中注意组织的夹取情况，减少对组织的挤压。
1.3 Q：组织形态皱缩是怎么回事？
A：针对这种情况冷冻温度和时间的控制则极为重要，冷冻温度不要过低，一般以- 18℃为宜。冷冻时间要严格控制不要过长，随时观察冻上即可。这样可以有效地避免组织过度收缩。
1.4 Q：组织形态变型严重是怎么回事？
A：有可能是使用的包埋盒体积过小，在包埋的过程中，包埋剂膨胀，对组织进行了挤压，导致组织变形严重，建议更换大一些的包埋盒进行重新包埋。
1.5 Q：样品中冰晶过多如何避免？
A：取材后的组织宜先用干纱布在组织表面轻轻按压，尽量将组织表面的水分吸干；包埋时在冷冻托上滴加包埋剂的厚度较一般组织适当增加（0. 6 cm 厚度为宜），这样可以使组织离冷冻托不至太近，从而避免冷冻过度；部分文章中还认为应置入-80℃冰箱速冻使其跨过冰晶形成温度。
二、冷冻切片
2.1 Q：冰冻切片发生卷缩怎么办？如何补救？
A：
(1) 使用防卷板，使冰冻切片进入防卷板后进行展片，可在一定程度上防止冰冻切片的卷缩。
(2) 考虑是否室内温度与切片机箱体温度温差过大，如环境温度过高，有可能会导致冰冻切片发生卷曲。
(3) 防卷板是否干净，保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤，其边缘应于切片刀边缘平行。
(4) 是否切片时间过长，导致冷冻室温度降低，应注意时间间隔，，盖上冷冻室盖，降低防卷板温度。
补救：可用毛笔的笔尖轻轻的扫过切片补救，使其展开，注意不要碰到组织。
2.2 Q：载玻片粘不上切片怎么回事？
A：此情况多见于载玻片温度过低，只要使载玻片与切片间有一定温度差，切片即可贴到载玻片上，一般将载玻片置于常温即可。
2.3 Q：冰冻切片破碎不全是什么情况导致的？
A：
(1) 组织块复温时间不够，组织块过冷，过硬，切片易发生破碎。
(2) 箱体温度设置不当。温度设置过低，组织块过冷，切片易破碎；箱体温度设置过高，组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到成片的要求，切片会易粘易碎。
(3) 组织块可能过大或包埋过程中产生过多冰晶。
(4) 切片刀使用时间过长，使其较脏或较钝，切片出现划痕，使切片不完整。
(5) 操作手法不当。
2.4 Q：箱壁和切片机上结霜
A：
(1) 冷冻切片机遇到气流(开窗、开门、开空调) 。可移至无通风处；
(2) 呼吸气流进入冷冻箱导致。
2.5 Q：切片软化
A：防卷板冷冻不足,使切片升温
2.6 Q：切片不平整
A：
(1) 防卷板位置不正确。重新放置防卷板。
(2) 防卷板未与刀刃对齐。正确对齐。
(3) 间隙角不正确。正确设置角度
(4) 刀和/或防卷板不干净。
(5) 防卷板边缘损坏。
(6) 切片刀变钝。
2.7 Q：防卷板上的切片打卷
A：防卷板超出刀刃不够
2.8 Q：切片和样本回位时有摩擦声
A：防卷板超出刀刃过多，刮到样品
2.9 Q：切片时发出咯咯声
A：
(1) 样品托未夹紧。
(2) 切片刀未夹紧。
(3) 切片刀变钝。
(4) 刀片型号与待切样品不吻合。所选间隙角不合适。
2.10 Q：清洁时在防卷板和刀片上产生冷凝水
A：刷子、镊子以及布的温度过高
2.11 Q：防卷板调整后损坏
A：防卷板高出刀刃过多，按切片方向进行调整。
2.12 Q：切片厚薄不均
A：(1) 使用组织温度不精确。
(2) 刀片型号与待切样本不吻合。
(3) 刀背结冰。
(4) 手轮转速不匀或速度设置不精确。
(5) 切片刀未夹紧。
(6) 样品托未完全夹紧。
(7) 切片刀变钝、切片厚度不合适、间隙角不正确。
(8) 样品干缩。
2.13 Q：组织粘在防卷板上
A：(1) 防卷板位置过高或位置不当。
(2) 防卷板边角有油脂。
(3) 防卷板未正确固定。
(4) 切片刀生锈。
2.14 Q：组织皱缩在防卷板出，或切片切着切着就歪向一边皱缩，为何？如何处理？
A：包埋块左右两边的切口不平，不整齐。切片进入防卷板受力不均匀，剐蹭皱缩。可将包埋块左右两侧削平削整齐。切片时，包埋块切面为正圆形最易切片。
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