请问真菌的分子生物学鉴定一般方法步骤

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现代真菌鉴定分型方法

北京大学第一医院(100434) 王端礼

真菌 的 鉴 定不仅是临床的需要，在植物病理学、生物退化、生物技术和环境的研究都很重要。许多真菌已经鉴定到种，但是分类学家仍在忙于新种的描述和其分类的研究。有些菌种由于经济学的关系或是病理学的重要性，有深人的研究，其他则需要现代手段来进行研究。

一 、 形 态学

用表 型 特 征来进行分类鉴定，是过去和现在都普遍应用的方法。致病真菌的鉴定，需要光镜，现在更加上荧光显微镜和细胞化学，还有各种染色法，如子囊泡子染色法。真菌在宿主体内鉴定比较困难，如菌丝只能看到有无分隔，有无色素。需要培养来鉴定菌种。某些病例用种特异性抗体探针非常有用，但此种技术尚未在医真菌学领域内作为常规技术使用。合适的培养基培养鉴定菌种，是常用的方法。

医学 真 菌 学家常见到的是半知菌，要看抱子形态和抱子发生，看产抱细胞，即分生抱子梗。有两种型，一是芽生抱子发生，在产抱细胞上有一小点产生分生抱子，另一是叶状抱子发生，整个细胞是产抱细胞，分成一至数个细胞。基于超微结构观察，有许多词语，但未能普遍应用。有的真菌没有分生抱子，但仍有一些特征，如菌核(sclerotia)、厚壁抱子和一些特殊的菌丝结构，如皮肤癣菌。在少数情况下，一些机会真菌产生有性结构，有许多特点用于菌种鉴定，如子囊菌、担子菌和结合菌。

电镜 ， T EM是观察菌的断面，子囊菌酵母和担子菌酵母的横隔不同，SEM在实际应用有许多发现，如子囊菌的表面结构可以鉴定到种。

现 代 形 态学技术，如自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学分析形态学的特点。

由于 表 型 各种词语没有一定的标准，有很大的主观性，某些表型特征也不稳定，受环境影响，有的不能在人工培养基上生长，有一些真菌尚未分类，分类概念有待近一步建立。

二 、分 子 生物学

表型 分 类 受限，生理生化技术在丝状真菌鉴定方面，或是费时费事或是结果不准。分子生物学非常适用。有两种技术，第一，PCR技术，可以分析少量真菌细胞，甚至单个真菌抱子。第二，选择通用寡核昔酸对真菌种特异性引物，测定其核昔酸序列。分子生物学的研究目的由于生物多样性有四个目的。I)系统发生研究。2)分类学的研究，在属、种水平。3)鉴定应用，即决定明确的分类名称。4)流行病学和群体的遗传学研究。具体方法不再详述。

三 、其 他 :

I，生 理 学 和生物化学

在纯 培 养 上真菌生长比较快，可以使用生理、生化方法来鉴定菌种。如黑酵母的鉴定。不同的生长温度也用于鉴定。有性和无性是一个辅助工具。在一定的培养基上，有对照，其生长速度也可用于鉴定，如青霉。AP[系统也用于丝状真菌的鉴定。

2. 次 级 代谢产物

次级 代 谢 产物既不是为了生长需要，也不是介导基本代谢，常常发现它是一个与分了有关的混合物，有特殊的和极罕见的化学结构。常见的是固醇、菇、类碱、香豆素等，某些是真菌毒素。将小量从培养皿切下来的标本，直接进行层析色谱法检查，比传统浓缩抽取提纯法简单易行。此法用于地衣的鉴定较好。很少用于真菌分类，由于对环境有一定影响，而且比较难，较少应用，但有人用于子囊菌的分类。

3. 泛 酉昆 系统

是一 种 初 级代谢产物，起重要作用。泛酿即辅酶Q，是呼吸系统电子传播链的携带者。一些异戊二烯(isoprene)接触醒核各有不同，对鉴定到属或属以下水平很有帮助。主要鉴定细菌和酵母，也用于黑酵母和丝状真菌。

(Ya ma da Y ,e tal. In t.J.Genet 19895 6:309 Y ag uchiJ >e tal .M ycoscience 19963 7:55)0

4. 脂 肪 酸组成

此法 在 细 菌学方面是常规应用的。一是成分，二是相对浓度。极少用于真菌分类。使用热解气相色谱法、热解块状光谱仪、气相色谱仪、隔膜水相聚合物双相系统等，主要应用这些方法。近来应用气相色谱法合并多变量统计分析方法，成功地用于丝状真菌，包括卵菌、担子菌、结合菌、甚至只有菌丝的真菌。用于种间水平。应注意许多变化，如培养状态和温度是最主要的。

5. 细 胞 壁组成

子 囊 菌 和担子菌含有几丁质和葡萄糖，结合菌含有脱乙酞几丁质(chitosen)和葡聚糖醛酸。不同的皮肤癣菌含有不同的糖分，醉母细胞壁或是缺乏或是含有少量其他多糖(如岩藻搪、乳糖、鼠李糖、木搪等)。

6. 蛋 白 质组成

用 电 泳 方法可以产生同工酶，可鉴定到属或种。电泳、免疫学方法、蛋白质分析等可解决种间特性。同工酶分析是一个经济和实用技术。等位基因酶(allozyme)通常用于系统发生的研究。

就我知道的来说，跨度不是很大，生物的如果是高分子方向整天也是做TEM，SEM，红外，X射线衍射那些，要是微生物就比跟材料差别很大了。四大化学是所有化学专业都学的，其实有这个基础学什么化学都没问题的，关键在于兴趣，个人感觉材料化学挺有前景的，像做碳纳米管，纳米模版，形状记忆合金，高导或者液晶的都很不错，就业也还算可以。

相反生物化学读研基本只能留研究所了，大部分都会继续读博，听说有搞海洋生物学的貌似还行，其他的就....，搞纯生物的很难就业。

以上是个人浅见，希望不要误导你，其实我觉得材料就很好的，身边好多化学转材料的。

曾主持的课题有：

1.国人唇眼脸头皮淋巴系研究（1986-1989，武汉大学)

2.抗原通过上皮细胞机理及体系分布（1997-1998，Norwegian Research Council）；

3.牙釉质SEM研究及研究方法和分子生物学机理（1998-2003 Norwegian Research Council）；

4.挪威牙体丙牙釉质牙本质超微结构研究（2003-2005 Norwegian Dental Research Council）。

曾经发表的主要论著有：

1.Chunfang Li，Steinar Risnes：SEM observations of Retzius lines and prism cross-striation in human dental enamel after different acid etching regimes，Archives of Oral Biology,2004. 49 (1).45-52

2.Chunfang Li,Steinar Risnes:A comparison of resins for embedding teeth,with special emphasis on adaptation to enamel surface as evaluated by scanning electron microscopy. Arch. Oral Biol. 2004 49 (1) 77-83

3.Chunfang Li:“Observation on the structure of human dental enamel in the SEM with emphasis on specimen preparation procedures”(05.06.03).Chunfang Li Dr.philos.

4.皮昕，李春芳：全国高等医药院教材《口腔解剖生理学》第六版，人民卫生出版社.

5.皮昕，李春芳：全国高等学校配套教材《口腔解剖生理学复习应试指南》第二版，人民卫生出版社.

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