怎么分析微生物群落结构和多样性

微生物群落的种群多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。近几年来，微生物群落结构成为研究的热点。首先，群落结构决定了生态功能的特性和强弱。其次，群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。再次，群落结构变化是标记环境变化的重要方面。因此，通过对目标环境微生物群落的种群结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。

从年代上来看，微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段。20世纪70年代以前主要依赖传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，对环境微生物群落结构及多样性的认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人员通过对微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了一些微生物分类和定量的方法即生物标记物方法，对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代，现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。

1 传统培养分离方法

传统培养分离方法是最早的认识微生物群落结构和多样性的方法，自1880年发明以来一直到

现在仍被广泛使用。传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅占环境微生物总数的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化。

2 群落水平生理学指纹方法(CLPP)

通常认为微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。酶分子对于所催化的生化反应特异性很高，不同的酶参与不同的生化反应。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一，标记了某种群的存在。由Garlan和Mills[2]于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)是通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性分析方法。具体而言，CLPP分析方法就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源基质的利用能力，来确定那些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。由BIOLOG公司开发的BIOLOG氧化还原技术，使得CLPP方法快速方便。商业供应的BIOLOG微平板分两种：GN和MT，二者都含有96个微井，每一

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微井平板的干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微平板含有95种不同碳源和一个无碳源的对照井，而MT微平板只含有培养基和氧化还原染料，允许自由地检测不同的碳源基质[3]。检测的方法是：将处理的微生物样品加入每一个微井中，在一定的温度下温育一定的时间(一般为12 h)，在温育过程中，氧化还原染料被呼吸路径产生的NADH还原，颜色变化的速率取决于呼吸速率，最终检测一定波长下的吸光率进行能源碳的利用种类及其利用程度的分析[4]。

BIOLOG方法能够有效地评价土壤和其它环境区系的微生物群落结构[3~6]。其优点是操作相对简单快速，而且少数碳源即能区别碳素利用模式的差别[5]。然而，BIOLOG体系仅能鉴定快速生长的微生物，而且，测试盘内近中性的缓冲体系、高浓度的碳源及有生物毒性的指示剂红四氮唑(TTC)使得测试结果的误差进一步增大。姚槐应[5]的研究表明，应根据测试对象的特点（例如pH，碳源利用类型及利用能力）改进BIOLOG体系，并且，有必要研究更好的指示剂来取代TTC。

3 生物标记物方法

生物标记物(Biomakers)通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。由于特定结构的标记物标志着特定类型的微生物，因此一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。由于分类的依据是从混合微生物群落中提取的生化组成成分，潜在地包括所有的物种，因而具有一定的客观性。并且分析简便快速，适于定性甚至半定量地检测微生物体系的动态变化。20世纪80年代以来常用于研究微生物群落结构的生物标记物方法包括：醌指纹法(Quinones Profiling)、脂肪酸谱图法(PLFAs和WCFA-FAMEs)。测定时，首先使用合适的提取剂提取环境微生物样品中的这些化合物并加以纯化，然后用合适的溶剂制成合适的样品用GC或LC检测，最后用统计方法对得到的生物标记物谱图进行定性定量分析。

3.1 醌指纹法(Quinones Profiling)

呼吸醌广泛存在于微生物的细胞膜中，是细胞膜的组成成分，在电子传递链中起重要作用[7]。醌的含量与土壤和活性污泥的生物量呈良好的线性关系的研究表明，醌含量可用作微生物量的标记[8]。有两类主要的呼吸醌：泛醌(ubiquinone, UQ)即辅酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即维生素K[9]。醌可以按分子结构在类(UQ和MK)的基础上依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的

氢原子数进一步区分。研究表明，每一种微生物都含有一种占优势的醌[7]，而且，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌[9]。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。

用醌指纹法描述微生物群落的参数[7]有：(1)醌的类型和不同类型的醌的数目；(2)占优势的醌及其摩尔分数含量；(3)总的泛醌和总的甲基萘醌的摩尔分数之比；(4)醌的多样性和均匀性；(5)醌的总量等。对两个不同的群落，由上述分析所得数据可以计算出另一个参数____非相似性指数(D)，用于定量比较两个群落结构的差异。

醌指纹法具有简单快速的特点，近几年来广泛用于各种环境微生物样品(如土壤，活性污泥和其它水生环境群落)的分析。

考察了醌指纹法分析活性污泥群落的分析精度，证明此方法是一种可靠的分析方法。然而，醌指纹法也存在一定的局限性，它不能反映具体哪个属或哪个种的变化。 3.2 脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)

从微生物细胞提取的脂肪类生化组分是重要的生物量标记物，例如，极脂(磷脂)、中性脂类(甘油二酯)可分别作为活性和非活性生物量的标记物[10]。更重要的是，提取脂类的分解产物____具有不同分子结构的混合的长链脂肪酸，隐含了微生物的类型信息，其组成模式可作为种群组成的标记。多种脂肪酸谱图法广泛用于土壤、堆肥和水环境微生物群落结构的分型和动态监测[11~13]。

常用的脂肪酸谱图法可分为两种：磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法和全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法[14]。二者分析的对象实质上都是脂肪酸甲酯，不同之处在于提取脂肪酸的来源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法提取的脂肪酸主要来源于微生物细胞膜磷脂即来源于活细胞，全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法提取的脂肪酸来源于环境微生物样品中的所有可甲基化的脂类即来源于所有的细胞（包括活细胞和死细胞）。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法的优点在于准确，可靠；全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法的优点在于提取简捷，所需样品量少。对多个环境微生物样品分析而言，先用WCFA-FAMEs谱图法预先筛选再用PLFAs法进行分析是提高效率的较佳选择。

脂肪酸谱图分析包括两种形式：一种是脂肪酸，采用GC分析仪达到分离不同结构的分子的目的；另一种是脂肪酸甲基化产物____脂肪酸甲酯，采用GC-MS分析仪进行不同分子的分离和鉴定。

微生物群落是广泛存在于生态系统中的一种结构单位和功能单位，它们是生态系统内充满生气的一部分，群落中各种不同的种群能以有规律的方式共处，同时它们具有各自明显的营养和代谢类型。从某种意义上说，群落的发展导致了生物的发展。在一定区域里，或一定生境里，各种微生物种群相互松散结合，或有组织紧凑结合的一种结构单位。在微生物群落中各种群之间相互作用。 微生物群落结构分析的意义能够更好的把握个菌种之间的共，寄生等和谐的生活关系。比如通过对肠道菌群的分析。

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