扩增反应结束
我
般通
凝胶电泳
扩增产物进行定性
析
PCR扩增反应进行实
检测
起始模板准确定量
情况
我
所
兴趣
起始模板量
转基
植物
插入某种外源基
拷贝数或者病
某种病毒DNA/RNA
精确copy数等
荧光定量PCR技术便应运
1、荧光定量PCR概念
所谓定量PCR技术（real-time
PCR）
指
PCR反应体系
加入荧光基团
利用荧光信号累积实
监测整
PCR进程
通
特定数
原理
未知模板进行定量
析
2、荧光定量PCR与普通PCR
主要区别
理论
PCR
指数增
程
实际
PCR扩增曲线并
标准
指数曲线
S形曲线
随着PCR循环
增
扩增规模迅速增
Taq酶、dNTP、引物
甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐
敷需求
PCR
效率越
越低
产物增
速度
逐渐减缓
所
Taq酶都
饱
PCR
进入
平台期
由于各种环境
素
复杂相互作用
同
PCR反应体系进入平台期
机
平台期
高低都
变化
难
精确控制
所
即使
96
PCR重复实验
各种条件基本
致
所
结
差异（
图）
所
实验
程
我
能根据
终PCR产物
量直接计算
起始DNA拷贝数
荧光定量PCR扩增曲线
三
阶段：荧光背景信号阶段（基线期）
荧光信号指数扩增阶段（
数期）
平台期
基线期
扩增
荧光信号
荧光背景信号所掩盖
我
判断产物量
变化
平台期
扩增产物已
再呈指数级
增加
由于PCR
终产物量与起始模板量
间没
线性关系
所
根据
终
PCR产物量
能计算
起始DNA拷贝数
荧光信号指数扩增阶段
PCR产物量
数值与起始模板量
间存
线性关系
我
选择
阶段进行定量
析
3．2荧光阈值
我
般
荧光PCR
前15
循环信号作
荧光本底信号（baseline
基线期）
即
本
荧光背景值
阴性
照
荧光值
扩增
荧光信号
荧光背景信号所掩盖
荧光阈值
荧光扩增曲线
设定
值
设定
荧光信号指数扩增阶段任意位置
荧光域值
缺省设置
3～15
循环
荧光信号
标准偏差
10倍（机器自
设置）
我
做荧光定量PCR实验
经
采用手
设置
手
设置
原则要
于
本
荧光背景值
阴性
照
荧光
高值
同
要尽量选择进入指数期
初阶段
真
信号
荧光信号超
域值
荧光定量
PCR
反应
引入
种荧光化
物质
随着
PCR
反应
进行
PCR
反应产物
断累计
荧光信号强度
等比例增加
每经
循环
收集
荧光强度信号
我
通
荧光强度变化监测产物量
变化
条荧光扩增曲线图
般
言
荧光扩增曲线扩增曲线
三
阶段：荧光背景信号阶段
,
荧光信号指数扩增阶段
平台期
荧光背景信号阶段
扩增
荧光信号
荧光背景信号所掩盖
我
判断产物量
变化
平台期
扩增产物已
再呈指数级
增加
PCR
终产物量与起始模板量
间没
线性关系
所
根据
终
PCR
产物量
能计算
起始
DNA
拷贝数
荧光信号指数扩增阶段
PCR
产物量
数值与起始模板量
间存
线性关系
我
选择
阶段进行定量
析
定量
比较
便
实
荧光定量
PCR
技术
引入
两
非
重要
概念：荧光阈值
CT
值
荧光阈值
荧光扩增曲线
设定
值
设定
荧光信号指数扩增阶段任意位置
般我
荧光域值
缺省设置
3-15
循环
荧光信号
标准偏差
10
倍
每
反应管内
荧光信号
达设定
域值
所经历
循环数
称
CT
值（
threshold
value
）
CT
值与起始模板
关系研究表明
每
模板
CT
值与该模板
起始拷贝数
数存
线性关系
起始拷贝数越
CT
值越
利用已知起始拷贝数
标准品
作
标准曲线
其
横坐标代表起始拷贝数
数
纵坐标代表
Ct
值
要获
未知
品
Ct
值
即
标准曲线
计算
该
品
起始拷贝数
荧光定量PCR原理：
随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值。
荧光域值（threshold）
是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即threshold。
Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。
Ct值与起始模板的关系：
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量检测
荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；
荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。
嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）
SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。
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