关于定量PCR荧光信号强度

关于定量PCR荧光信号强度,第1张

规PCR

扩增反应结束

般通

凝胶电泳

扩增产物进行定性

PCR扩增反应进行实

检测

起始模板准确定量

情况

兴趣

起始模板量

转基

植物

插入某种外源基

拷贝数或者病

某种病毒DNA/RNA

精确copy数等

荧光定量PCR技术便应运

1、荧光定量PCR概念

所谓定量PCR技术(real-time

PCR)

PCR反应体系

加入荧光基团

利用荧光信号累积实

监测整

PCR进程

特定数

原理

未知模板进行定量

2、荧光定量PCR与普通PCR

主要区别

理论

PCR

指数增

实际

PCR扩增曲线并

标准

指数曲线

S形曲线

随着PCR循环

扩增规模迅速增

Taq酶、dNTP、引物

甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐

敷需求

PCR

效率越

越低

产物增

速度

逐渐减缓

Taq酶都

PCR

进入

平台期

由于各种环境

复杂相互作用

PCR反应体系进入平台期

平台期

高低都

变化

精确控制

即使

96

PCR重复实验

各种条件基本

差异(

图)

实验

能根据

终PCR产物

量直接计算

起始DNA拷贝数

荧光定量PCR扩增曲线

阶段:荧光背景信号阶段(基线期)

荧光信号指数扩增阶段(

数期)

平台期

基线期

扩增

荧光信号

荧光背景信号所掩盖

判断产物量

变化

平台期

扩增产物已

再呈指数级

增加

由于PCR

终产物量与起始模板量

间没

线性关系

根据

PCR产物量

能计算

起始DNA拷贝数

荧光信号指数扩增阶段

PCR产物量

数值与起始模板量

间存

线性关系

选择

阶段进行定量

3.2荧光阈值

荧光PCR

前15

循环信号作

荧光本底信号(baseline

基线期)

荧光背景值

阴性

荧光值

扩增

荧光信号

荧光背景信号所掩盖

荧光阈值

荧光扩增曲线

设定

设定

荧光信号指数扩增阶段任意位置

荧光域值

缺省设置

3~15

循环

荧光信号

标准偏差

10倍(机器自

设置)

做荧光定量PCR实验

采用手

设置

设置

原则要

荧光背景值

阴性

荧光

高值

要尽量选择进入指数期

初阶段

信号

荧光信号超

域值

荧光定量

PCR

反应

引入

种荧光化

物质

随着

PCR

反应

进行

PCR

反应产物

断累计

荧光信号强度

等比例增加

每经

循环

收集

荧光强度信号

荧光强度变化监测产物量

变化

条荧光扩增曲线图

荧光扩增曲线扩增曲线

阶段:荧光背景信号阶段

,

荧光信号指数扩增阶段

平台期

荧光背景信号阶段

扩增

荧光信号

荧光背景信号所掩盖

判断产物量

变化

平台期

扩增产物已

再呈指数级

增加

PCR

终产物量与起始模板量

间没

线性关系

根据

PCR

产物量

能计算

起始

DNA

拷贝数

荧光信号指数扩增阶段

PCR

产物量

数值与起始模板量

间存

线性关系

选择

阶段进行定量

定量

比较

便

荧光定量

PCR

技术

引入

重要

概念:荧光阈值

CT

荧光阈值

荧光扩增曲线

设定

设定

荧光信号指数扩增阶段任意位置

般我

荧光域值

缺省设置

3-15

循环

荧光信号

标准偏差

10

反应管内

荧光信号

达设定

域值

所经历

循环数

CT

值(

threshold

value

CT

值与起始模板

关系研究表明

模板

CT

值与该模板

起始拷贝数

数存

线性关系

起始拷贝数越

CT

值越

利用已知起始拷贝数

标准品

标准曲线

横坐标代表起始拷贝数

纵坐标代表

Ct

要获

未知

Ct

标准曲线

计算

起始拷贝数

荧光定量PCR原理:

随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。

荧光定量PCR最早称TaqMan PCR,后来也叫Real-Time PCR,是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的

一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。

而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT值。

荧光域值(threshold)

是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍,即threshold。

Ct 值:是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。

Ct值与起始模板的关系:

研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如下图所示。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量检测

荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术(分子信标技术,以美国人Tagyi为代表)、 TaqMan探针(以美国ABI公司为代表)和FRET技术(以罗氏公司为代表)等;

荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料,非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ;饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。

嵌合荧光染料法(SYBR GreenⅠ)

SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料,与双链DNA非特异性结合。在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合,其荧光增加1000倍。所以,一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列,且会随扩增产物的增加而增加。


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