pcr原始数据包括哪些

pcr原始数据包括原始图片，甚至还有荧光定量（qRT-PCR）的原始数据。

还有的机构要求有溶解曲线，扩增曲线，没有经过任何修饰的免疫组化、免疫荧光图片。其实在行内不论杂志社还是审稿人都对论文原始数据的重视度高了很多。

多数期刊都要求作者提供原始数据，如：Nature出版社的期刊是要求提供 WB 原始图片的（条带裁剪之前，或者不同曝光度）。

pcr的CT值

每个模板的CT值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系的，起始的拷贝数越大，CT值就越小。标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，根据RT-PCR的反应条件进行反应。

以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。同学们要注意这个过程必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒DNA（也可以是基因组DNA，纯化后的PCR产物等）。

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算；

3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。

扩展资料：

PVR的循环参数：

1、预变性；

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。

2、变性步骤；

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火；

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸；

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数；

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸；

在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

参考资料来源：百度百科—实时荧光定量PCR

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)。

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

扩展资料

传统定量PCR方法简介：

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。

扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

参考资料来源：百度百科-荧光定量PCR

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