保护碱基的添加原则

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

修饰碱基：

DNA和RNA分子中还含有核酸链形成后经过修饰形成的其它非主要碱基。这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化（methylation）或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。

DNA中最常见的修饰碱基是5-甲基胞嘧啶（m5C）。RNA中有许多修饰的碱基，包括核苷类假尿苷（Ψ）、二氢尿苷（D）、肌苷（I）和7-甲基鸟苷（m7G）中含有的碱基。

保护碱基通常是GCGC和GGCC，由于限制位点的掺入，经PCR扩增的靶DNA片断可以方便的克隆到所选的载体分子上，毕竟酶不可能那么精准的识别酶切位点。

如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），

相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色），

切割率：正确识别并酶切的效率

加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。

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