冰冻切片焦油紫染色法的实验原理

冰冻切片焦油紫染色法的实验方法原理：冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

实验材料：新鲜组织

试剂、试剂盒：H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性树上

仪器、耗材：OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜

实验步骤：

一取材

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

二速冻

1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

三固定

1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min

四切片

1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

2、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。

4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。

五免疫荧光染色

1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。

2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。

3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。

5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。

7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

转自病理人才汇

冰冻切片丙酮固定原理是使细胞内的物质接近生活状态时的形态结构。根据查询相关公开信息显示，冰冻切片可以直接用丙酮固定，固定的原理是采用蛋白质凝固剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。冰冻切片在手术台上取下的组织放到冷冻机里面负20度左右冻成硬块，制成切片用于快速诊断，该诊断仅作参考，应以石蜡诊断为主。

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