以上四个步骤,根据所使用的SEM成像的真空模式,可以有所省略。
如果用ESEM,取样后可直接放入样品室,在一定“环境真空”下进行观察;如果采用LV模式,直到干燥,可以免喷金;高真空模式,必须做到喷金等样品导电处理。
具体可到公益网站:中山大学生物电子显微学实验室网站查询
扫描电镜样品制备: 基础课程,生物样品因含水,其样品制备有其特殊性。
http://bioem.sysu.edu.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5
有时候公益网站有点那个,不好点开,请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/
扫描电镜成像原理主要有两种,二次电子像(secondary electron):形貌衬度,就是你的细菌外表有凸凹形貌,可以拍摄形貌像;背散射电子探头(back scatter electron):原子序数衬度,你可以进行染色,把一些重金属的盐类设法溶进细菌体内,然后用BSE观察时,细菌就是白亮的。具体不懂的可以联系我,希望对你有帮助。
细菌标本片的制备,实际上真没这必要,我一般碘酒,或者溴酚蓝滴上一染,盖上玻片就看了。1.抹片
(1)固体培养物:取洁净的玻片一张,把接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌后,取1-2环无菌生理盐水,放于载玻片的中央,再将接种环灭菌,冷却后,从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许,与水混匀,作成直径1cm的涂面。接种环用后需要灭菌。
(2)液体培养物:可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1-2环,在玻片上作直径1cm涂面。
(3)液体病料(血液,渗出液,腹水):取一张边缘整齐的载玻片,用一端蘸取血液等液体材料少许,在另一张洁净的玻片上,一45°角均匀推成一薄层的涂面。
(4)组织病料:以无菌剪刀、镊子剪去被检组织一小块,以其新鲜切面在玻片上做3-5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。
无论何种方法,切忌涂抹太厚,否则不利于染色和观察
2.干燥
涂片应在室温下自然干燥,必要时将涂片涂面向上,置于火焰高处微加热干燥。
3.固定
(1)火焰固定。是常用的方法,将干燥好的抹片涂面向上,在火焰上来回通过数次(4-6次),以手背触及玻片微烫手为宜。
(2)化学固定。有的血片,组织触片用姬姆萨染色时,要用甲醇固定3-5min
二、常用的细菌染色法
1.美蓝染色法:在经火焰固定的涂片上,滴加适量美兰染色液覆盖涂面,染色2-3min,水洗,晾干或吸水纸轻压吸干镜检,结果,菌体呈蓝色
2.革兰氏染色法。
(1)在固定好的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,染1-3min,水洗
(2)加革兰氏碘液媒染,作用1-2min,水洗
(3)加95%酒精脱色约30s至1min,水洗
(4)加稀释石碳酸复红或沙黄水溶液复染30s左右,水洗,吸干后镜检
3.瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后,滴加瑞士染色液于涂片上以固定标本,1-3min后,再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水与玻片上,轻轻摇晃使染色液混合均匀,5min左右水洗,干后镜检,菌体呈蓝色,组织细胞的胞浆呈红色,细胞核呈蓝色
4.姬姆萨染色法。血片或组织触片自然干燥后,用甲醇固定3-5min,干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的缸里,染色30min,或者染色数小时或24h,取出水洗,吸干或烘干,镜检。细菌呈蓝青色,组织细胞浆呈红色,细胞核呈蓝色
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