要对细菌做SEM，前处理是什么？需要把细菌弄成干态或者固定是吗？求详细的步骤

取样，戊二醛等固定液固定，酒精梯度脱水，冷冻干燥or二氧化碳临界点干燥，喷金或蒸碳。

以上四个步骤，根据所使用的SEM成像的真空模式，可以有所省略。

如果用ESEM，取样后可直接放入样品室，在一定“环境真空”下进行观察；如果采用LV模式，直到干燥，可以免喷金；高真空模式，必须做到喷金等样品导电处理。

具体可到公益网站：中山大学生物电子显微学实验室网站查询

扫描电镜样品制备: 基础课程，生物样品因含水，其样品制备有其特殊性。

http://bioem.sysu.edu.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5

有时候公益网站有点那个，不好点开，请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/

操作步骤

1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2．染色

（1）初染

加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染

滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色

将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染

用番红液染1—2分钟，水洗。

（5）镜检

干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

单染色法，以观察菌体形态为主。

1、把泡在酒精中的片子用镊子夹出，放在酒精灯上点燃，去掉片子上的酒精及油脂。

2、片子冷却后，蘸一接种环发酵液，均匀地涂在片子上。

3、涂后的片子，于酒精灯火焰上过几遍，使所涂的细菌固定在片子上，注意，片子温度不易过高，以不烫手背为主，温度过高，会使菌变形，影响观察结果。

4、片子涂菌的位置，滴几滴结晶紫染液，使染液完全覆盖住所涂的菌，染1分钟左右。

5、用水冲洗片子至无紫色水流下后，进行火焰烤干。

6、镜下观察。在涂点处滴1滴香柏油，于油镜下观察菌体形态。

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