以上四个步骤,根据所使用的SEM成像的真空模式,可以有所省略。
如果用ESEM,取样后可直接放入样品室,在一定“环境真空”下进行观察;如果采用LV模式,直到干燥,可以免喷金;高真空模式,必须做到喷金等样品导电处理。
具体可到公益网站:中山大学生物电子显微学实验室网站查询
扫描电镜样品制备: 基础课程,生物样品因含水,其样品制备有其特殊性。
http://bioem.sysu.edu.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5
有时候公益网站有点那个,不好点开,请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/
操作步骤1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。
2.染色
(1)初染
加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。
(2)媒染
滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。
(3)脱色
将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。
(4)复染
用番红液染1—2分钟,水洗。
(5)镜检
干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。
单染色法,以观察菌体形态为主。1、把泡在酒精中的片子用镊子夹出,放在酒精灯上点燃,去掉片子上的酒精及油脂。
2、片子冷却后,蘸一接种环发酵液,均匀地涂在片子上。
3、涂后的片子,于酒精灯火焰上过几遍,使所涂的细菌固定在片子上,注意,片子温度不易过高,以不烫手背为主,温度过高,会使菌变形,影响观察结果。
4、片子涂菌的位置,滴几滴结晶紫染液,使染液完全覆盖住所涂的菌,染1分钟左右。
5、用水冲洗片子至无紫色水流下后,进行火焰烤干。
6、镜下观察。在涂点处滴1滴香柏油,于油镜下观察菌体形态。
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