保护碱基怎么加

保护碱基通常是GCGC和GGCC，由于限制位点的掺入，经PCR扩增的靶DNA片断可以方便的克隆到所选的载体分子上，毕竟酶不可能那么精准的识别酶切位点。

如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），

相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色），

切割率：正确识别并酶切的效率

加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。

两侧，在各个酶的两边加上保护碱基。 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR 引物时，为保护5`端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。

添加保护碱基的原则

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

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