保护碱基怎么加

保护碱基通常是GCGC和GGCC，由于限制位点的掺入，经PCR扩增的靶DNA片断可以方便的克隆到所选的载体分子上，毕竟酶不可能那么精准的识别酶切位点。

如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），

相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色），

切割率：正确识别并酶切的效率

加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。

两侧，在各个酶的两边加上保护碱基。 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR 引物时，为保护5`端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。

添加保护碱基的原则

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

修饰碱基：

DNA和RNA分子中还含有核酸链形成后经过修饰形成的其它非主要碱基。这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化（methylation）或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。

DNA中最常见的修饰碱基是5-甲基胞嘧啶（m5C）。RNA中有许多修饰的碱基，包括核苷类假尿苷（Ψ）、二氢尿苷（D）、肌苷（I）和7-甲基鸟苷（m7G）中含有的碱基。

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