保护碱基的原理

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相邻的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

限制性内切酶 识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据 识别位点 两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA 双链 并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

原理

在 分子克隆 实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的 酶切位点 ，用于后续的酶切和 连接反应 。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被 限制性核酸内切酶 切开，因此在设计PCR 引物 时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

       在设计引物时如果没有加保护碱基，后续扩增出来的目的基因是不能做酶切实验的，效率不高，所以往往会在设计引物时在两头加上保护碱基，保护碱基的数量和种类往往也表现出个人偏好性，有的人喜欢加2个保护碱基，比如GC，有的人喜欢加四个碱基，比如ATAC，利于后边的酶切实验，可以直接酶切，如果保护碱基数量太少，不利于酶蛋白稳定的结合到DNA双链，从而不利于酶切。不一而足，不同的实验目的选用不同的保护碱基。

添加原则

编辑

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的 酶切位点 ，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条 引物 的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

保护碱基数目和酶切活性对应值表如下：

PS：酶切活性值出现空格时参考前一格。

胺基保护基，一般以FMOC-CL形式存在。结构如下：

Fmoc保护基的一个主要的优点是它对酸极其稳定，在它的存在下，Boc和苄基可去保护。Fmoc的其他优点是它较易由简单的胺不通过水解来去保护，被保护的胺以游离碱释出。一般而言Fmoc对氢化稳定，但某些情况下，它可用H2/Pd-C在AcOH和MeOH仲脱去。Fmoc保护基可与酸脱去的保护基搭配而用于液相和固相的肽合成。

例子：

Piperidine (0.66 ml) was addede to a solution of compound 1 (0.797 g) in MeOH (10 ml) at room temperature. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 h, then concentrated and the residue was purified by alumina column chromatography (rthyl acetate/methanol = 10/1) to obtain compound 2 (0.382 g, 76%).