电子显微镜样品如何制备？

投射电子显微镜的观察样品的主要制备方法有：

1、投影法

在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影我们可以了解样品的立体形状、高度，通常用这种方法来观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒。

2、负染法

因为这种方法是将样品的背景染色以突显样品，所以称为负染。一般是用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，例如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会投入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反应样品的内部结构。用这种方法可以观察细菌细胞、病毒等。

3、超薄切片法

这是最常用的方法，因为可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。通常是要按照一定程序对样品进行固定，脱水，然后包埋在树脂中作为支持物，用超薄切片机切成极薄的切片。因为只有在20～100纳米厚度的切片用投射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。

选择电子显微镜首先看扫描电子显微镜厂商是不是有齐全的证书；其次要看看扫描电子显微镜厂商的合同；再其次要了解扫描电子显微镜厂商的服务；另外则要看扫描电子显微镜技术参数。

除了扫描电子显微镜厂商的选择之外，在购买相应的扫描电子显微镜的时候还需要考虑到扫描电子显微镜的性能和技术指标，是否能够满足我们日常分析的需求，在购买的时候还需要考虑到各项技术参数，这样才会满足我们的检测分析使用。

徕卡显微系统为生物、医疗和工业样品的制备提供全面的产品组合。专注于工作流程解决方案，提供的产品完全匹配用户在TEM、SEM和AFM研究对中精确样品制备的所有需求。

共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。

标本可以是固定的或活的组织，也可以是固定的或活的贴壁培养，细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm，使用的盖玻片厚度应小于0.17mm，载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，而且表面光洁，厚度均匀，没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

常规样品制备要求：

1、染料的选择

由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题。

2、样品承载物的选择

一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

3、封片剂的选择

如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失。

切取好的试样，先经砂轮磨平，为下一道砂纸的磨制做好准备。磨平时应用水冷却试样，避免金属组织因受热而发生变化,

经砂轮磨平、洗净、吹干后的试样,用手工依次由粗到细的在各号砂纸上磨制,砂纸须平铺于平的玻璃、金属或板上。从粗砂纸到细砂纸,每换一次砂纸时,试样均须转90°角与旧磨痕成垂直方向,向一个方向磨至旧磨痕完全消失,新磨痕均匀一致时为止，磨制试样时,注意不可用力太重,每次时间也不可太长。

经砂纸磨光的试样,可移到装有尼纶、尼绒或细帆布等的抛光机上粗抛光,抛光料可用微粒的氧化铝、氧化镁、氧化铬、氧化铁、金钢砂等，抛光时间2～5min，抛光后用水洗净并吹干。

为进行显微镜检验，须对抛光好的金属试样进行浸蚀，以显示其真实、清晰的组织结构。

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