尽管有一些蛋白是经冷冻干燥处理后长出了晶体，但是大多数情况下并非如此。所以要尽可能避免冷冻干燥。如果蛋白已经这样了，准备点晶体之前，要用水或者缓冲液透析，除掉非挥发性的试剂和其他化学物质。
2. 避免硫酸铵沉淀
避免硫酸铵沉淀法作为纯化的最后一步或使用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白。因为硫酸铵很难除干净，对后续的结晶过程造成干扰。残存的微量的硫酸铵也会干扰晶体筛选的条件，造成结果的不可重复性。微量的硫酸铵也容易造成样品沉淀，以及在PEG和盐类物质存在时会出现过量的晶核。
3. 蛋白批次
在同一次条件筛选时，要避免样品不是同一批次纯化出来的。每一次纯化的条件和步骤都是不同的〔就像天下没有两片相同的树叶（Redondo添加）〕，所以筛选的时候应该使用同一批次纯化出来的蛋白。
4. 定性蛋白质
在拿去点晶体之前，应该定性判断你纯化出来的蛋白是不是你的目的蛋白。根据确定了的蛋白质性质，可以给筛选和优化提供参考。常用的蛋白质定性试验包括：
SDS-PAGE
Native PAGE
Dynamic Light Scattering
IEF (Isoelectric Focusing) Gel
Mass Spectroscopy
根据这些试验的结果，我们可以判断：
蛋白样品的纯度
蛋白样品的同次性
不同批次纯化出来的蛋白的性质差异
蛋白质的稳定性
5. 蛋白需要达到什么纯度？
要拿去筛晶体，蛋白样品需要达到什么纯度？答案是越纯越好。但是这样一个答案不能让人满意。如何能更容易理解一些呢？一开始筛选时，根据考马斯亮蓝染色判断蛋白纯度应该达到90 到 95%。不过，考虑到总有进一步纯化的步骤，不可能达到‘绝对’的100%纯，所以没有必要追求‘绝对’纯，存在一点点的杂质蛋白是可以接受的。还要记住，结晶本身就是一个纯化过程。当筛选过程中没有晶体长出，甚至没有长的迹象，或者在优化条件时不能进一步提高晶体的质量了，这个时候就要考虑进一步提高蛋白浓度了。
6. 样品的保存
一般蛋白都可以在4°C 或 -70°C保存。与制备样品的人交流一下或者查阅文献中报道的类似蛋白的保存方法，选择一个合适的缓冲液体系和保存温度。在保存之前，应该测定蛋白的活性和稳定性，并隔一段时间取出一点蛋白来测定其活性是否改变及有没有降解发生。反复冻溶对蛋白是不利的，应尽量避免。样品应该分装成小份，每次取出当次试验需要的量，保证取出来的正好用完。有时候，一些人喜欢加入甘油（10 to 50% v/v）来保护蛋白不被冻伤。但是应该尽量避免加入甘油，因为甘油很难通过透析或者过滤来除干净，残存的甘油会给长晶体带来变数。甘油在不同条件下可能是沉淀剂，也可能是additive（促溶剂？）或冷冻保护剂。一般来讲，蛋白浓度越高越利于保存。但是，当蛋白浓度很高时，保存期间也容易产生沉淀。将保存的蛋白做好标记，是何批次纯化的，蛋白浓度多高，以及保存的时间等。将同一个批次的蛋白分装好保存到同一个大的离心管里，这样方便管理。
7. 蛋白样品操作中要注意的
Be nice to your protein.要记得蛋白可是微生物们的美餐，不要让它们偷吃了你的蛋白。平时，蛋白一定要在4° C或更低温度放置，暴露在室温的时间要尽可能地短。当溶化一个蛋白样品或将冷冻干燥的蛋白复溶的时候，不要摇晃或震荡，不要产生气泡，出现气泡往往标志着蛋白变性了。当确定了点晶体时操作间的温度，应预先将蛋白样品在这个温度放置一会儿。在蛋白结晶的领域里存在很多的不同的主张。比如，有人认为在点晶体之前应过滤蛋白除掉可能存在的细菌和蛋白聚集体及杂质等，而有人在认为不应该过滤或离心，那些并不明显的蛋白聚集体或杂质等可能是结晶所需的晶核。
8. 要不要加叠氮化钠？
NaN3是一种有效抑制细菌污染的添加剂。常用的工作浓度为1 mM或0.02% 到 0.1% w/v.因为叠氮化钠有毒，所以操作时一定要小心。当决定添加叠氮化钠了，就需要注意以下几点：
它能杀菌，对人体也是有害的。
它是某些蛋白的抑制剂，可能影响试验。
It can interfere with heavy atom derivatization.
一些叠氮化物是爆炸性的
有报道指出除掉叠氮化钠能促进晶体生长
可以替代叠氮化钠的试剂有麝香草酚（Thymol）和Thimerosal。
还有其他的方法，那就是每一步操作时都保证仪器和器材（灭菌枪头等）都是无菌的，溶液都要过滤除菌，并在4°C或更低温度保存。所有这些细节都做好了，就可以避免使用化学添加剂来防菌了。
9. 试验记录要做好
纯化，保存，点晶体等每一个步骤都应该详细记录。筛晶体时各个条件也都要做好记录以备需要时查阅。这些需要记录的项目包括：
有关这个蛋白的信息
样品名称
样品的纯化批次，保存地点及时间，保存条件等
蛋白缓冲液的成分，添加剂浓度等
样品浓度
结晶试验的信息
方法
液滴大小及成分
池液的成分
温度
日期
实验者
乍看起来这有些过于拘泥细枝末节，但是要知道所记录下的这些信息都可能成为结晶筛选的一个变量。做详尽准确的试验记录是必要的。在记录结晶的情况时，一些描述性的和定量的记录都应该有。最后，还有保持操作间的整洁卫生，避免化学物质和细菌的污染。好的习惯长远来看会让人受益良多。
10. 关于你的样品还应该掌握的信息：
是否有同源性很高的蛋白已经解出结构了？
样品中存在自由的半胱氨酸吗？
样品中有哪些添加剂？
样品上是否有糖基？
样品蛋白是否是磷酸化的？
样品N端是否甲基化？
样品在什么温度下稳定？
样品的活性和稳定性随温度如何改变？
样品的可溶性和稳定性随pH如何变化？
样品结合金属离子吗？
样品对蛋白酶敏感否？
我的样品属于酶，膜蛋白，抗体？
对这类的蛋白通常使用什么方法？
样品蛋白的来源？
蛋白样品到达我手上之前如何纯化和保存的？
样品的缓冲液体系？
是否同一批次纯化出来的？
我手上有多少蛋白？我还能获得多少？
蛋白纯度如何？
均一性同次性如何？
这个蛋白独特的性质是什么？
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。
将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。
溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；
除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；
沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；
溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解,得DNA溶液。
溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。
在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？ 加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳
苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1？
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
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