大肠杆菌的检查方法

细菌的分离鉴定

1、标本：肠道外感染取中段尿、血液、脓液、脑脊液等，腹泻者取粪便。

2、分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。其他标本可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。37℃孵育18～24小时后，观察菌落并涂片染色镜检。采用一系列生化反应进行鉴定。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要时检定肠霉毒素。

泌尿系统除确定大肠杆菌外，还应计数，每毫升尿含菌量≥100，000时，才有诊断价值。

卫生细菌学检查

大肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。

1、细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采用倾注培养计算。中国规定的卫生标准是每毫升饮水中细菌总数不得超过100个。

2、大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国的卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群；瓶装汽水、果汁等每100ml大肠菌群不得超过5个。

全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测

全自动微生物定量分析（TEMPO）仪的大肠杆菌群计数检测有TC和CC两种方法。TEMPO TC的开发是为了获得NF ISO4832标准相当性能水平。TEMPO CC法是TEMPO仪器上根据BAM方法专门用于24h计数食品中大肠杆菌群的方法。该法是为了获得和AOAC官方方法966.24及美国公共健康联合会检测乳制品检测方发（SMEDP）一致的效果。TEMPO系统根据阳性空的大小和数目来推算出原始样本中大肠杆菌群数目。

食品检测方法 大肠菌群MPN 计数法 1 样品的稀释 1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,

8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋

中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。

1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶

（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。

1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液

或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌

吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释

1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 2.初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3

管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36

℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续

培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 3.复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1

℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 4.大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的

MPN值。 大肠菌群平板计数法 1 样品的稀释 按上一方法稀释。 2 平板计数 2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐

水加入无菌平皿作空白对照。

2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心

旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平

板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 3 平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。 4 证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃

培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

大肠杆菌检验（包括(一)检验方法；(二)培养基 ）

(一)检验方法

1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。

2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃ 温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革

兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

4．报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l 00ml(g)大肠菌群的最可能数。

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(二)培养基

①乳糖胆盐发酵培基

成分：蛋白胨：20g

猪胆盐(或牛，羊胆盐)：5g

乳糖:10g

0．04％溴甲酚紫水溶液: 25m1

蒸馏水: 1 000m1

制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管l 0ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。

附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。

用途：乳糖发酵试验用。

原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。

乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。

糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。

大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。

注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)

②伊红美蓝琼脂培基

成分：蛋白胨 10g

乳糖10g

磷酸氢二钾 2g

琼脂17g

2％伊红Y溶液 20ml

0．65％美蓝溶液 10ml

蒸馏水1000ml

pH7.1

制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121℃15分钟备用。临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。

③乳糖发酵培基

成分：蛋白胨 20g

乳糖 10g

O．04％溴甲酚紫水溶液25ml

蒸馏水 1000ml

pH7．4

制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。

附注：’

(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。

(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群

证实试验用。

4．蛋白胨水

成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g

氯化钠 5g

蒸馏水 1 000ml pH7．4

取样，戊二醛等固定液固定，酒精梯度脱水，冷冻干燥or二氧化碳临界点干燥，喷金或蒸碳。

以上四个步骤，根据所使用的SEM成像的真空模式，可以有所省略。

如果用ESEM，取样后可直接放入样品室，在一定“环境真空”下进行观察；如果采用LV模式，直到干燥，可以免喷金；高真空模式，必须做到喷金等样品导电处理。

具体可到公益网站：中山大学生物电子显微学实验室网站查询

扫描电镜样品制备: 基础课程，生物样品因含水，其样品制备有其特殊性。

http://bioem.sysu.edu.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5

有时候公益网站有点那个，不好点开，请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/

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