实验细胞的活力测定MTS法

BrdU标记法 1．细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％ FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期。 2．终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L），37℃，孵育40min。 3．弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。 4．甲醇/醋酸固定10min。 5．经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。 6．5％正常兔血清封闭。 7．甲酰胺100℃，5min变性核酸。 8．冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。 9．按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。 结晶紫法 1．体外细胞培养结束后，去培养液，加入11％的戊二醛固定，置于振荡器上摇20min。 2．固定细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。 3．置空气或烘箱37℃彻底干燥。 4．加入0.1％的结晶紫液对细胞染色，振摇30min。 5．用蒸馏水洗涤，至多余的结晶紫液冲洗干净。 6．置空气或37℃烘箱中彻底干燥。 7．加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取。 8．1h后在酶标仪上测定光吸收度，波长595nm。 酸性磷酸酶法 1．96孔细胞培养板中培养细胞，去培养...

293T细胞的培养 293T细胞是由293 细胞派生, 表达SV40 大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。 293T 为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。培养条件为: 完全培养基: 高糖 DMEM, 10% 胎牛血清冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。 传代方法为: 1．吸掉293T 细胞培养瓶内的培养液2．吸取适量的无Ca2+ 和Mg2+ 的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍3．加少量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2 的培养瓶加1 ml, 75 cm2 的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。有些同学反映293T 细胞容易结团不易被吹打开来。如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml 移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。一般293T 细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90% 融合, 再以1∶4~1∶8 的比率传代。合适的传代周期为2~3 天。传代过程中, 消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。完成传代后放入培养箱前, 应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。冷冻293T 细胞的冻存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亚砜, 复苏率很高。 293T细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率, 应尽量选择传代次数少, 培养总时间短的细胞。从细胞形态上看, 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。 虽然293T细胞的应用非常广泛, 几乎每个实验室都有一株自己的293T 细胞株, 但是经常有同学提出: 为什么在正常的培养条件下, 细胞却很难传代下去, 包装病毒效率很低, 对转染效率也不满意呢？ 事实上, 引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。支原体污染后, 它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存, 培养基不发生浑浊, 细胞无明显变化, 外观上给人以正常感觉, 但事实上细胞正在受到到多方面影响, 如引起细胞变形, 影响DNA 合成, 抑制细胞生长等。我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的293T 细胞, 经检测均为支原体阳性, 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的293T 细胞形态, 每两株之间比较竟然形状各不相同, 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长, 显微镜下观察细胞碎片多, 长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪, 胞内DNA 和蛋白质合成受到严重的影响。 因此, 有效地防治支原体污染, 杜绝交叉感染对提高实验效率, 稳定实验结果至关重要。我们的经验是把防治支原体污染作为细胞培养的一项日常工作, 除了对细胞培养设备环境的清洁外, 还需在器材消毒, 操作员培训, 严格把关新引入细胞株的质量等方面做大量细致的工作。

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