早期胃癌和癌前病变的诊断新方法，与旧方法比有哪些优势？

早期胃癌内镜或手术治疗的总生存率可超过 96%，而西方世界的大多数胃癌病例都是在晚期确诊的，累积 5 年生存率范围为 20-40%。通常，早期胃癌没有任何症状，因此降低晚期胃癌死亡率的办法是及时发现，无论是通过胃镜检查还是无创检查。

传统肿瘤标志物

癌胚抗原 (CEA) 和传统肿瘤标志物，即糖类抗原 72-4 (CA 72-4)、糖类抗原 19-9 (CA 19-9)、糖类抗原 15-3 (CA 15-3) 和糖类抗原12-5 (CA 12-5)主要用于治疗监测和预后判断，而不是早期检测或筛查胃癌。尽管在胃癌中可以发现它们的水平升高，但它们既不敏感也不特异，而且它们通常在疾病晚期升高。

胃黏膜萎缩标志物

胃蛋白酶原

胃蛋白酶原可在血液中作为胃粘膜变化的间接标志物进行测量。 胃蛋白酶原 I (PgI) 和胃蛋白酶原 II (PgII) 两种同工酶原在胃的不同部位产生。胃蛋白酶原I 的产生仅限于胃体（近端胃）的分泌酸的腺体，而胃蛋白酶原II广泛存在于整个胃的不同类型的腺体以及十二指肠的 Brunner 腺体中。 粘膜炎症的存在，以及幽门螺杆菌感染，可能会增加 胃蛋白酶原I 和 胃蛋白酶原II 的水平，并且在某些情况下，当萎缩和炎症都存在时，会导致胃蛋白酶原I 值正常。 考虑到这一缺点，胃蛋白酶原I 与 胃蛋白酶原II 的比率降低 (胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原II) 被认为是胃萎缩的最佳血清学标志物。

应该认识到，胃蛋白酶原检测正在使用不同的方法（乳胶凝集、ELISA、化学发光酶免疫测定）。 尽管使用不同方法获得的结果之间存在良好的相关性，但在绝对数字中，结果可能会有所不同。 因此，必须针对所使用的方法专门确定临界值，可能还要在不同人群中进行调整。

一些荟萃分析已经解决了胃蛋白酶原检测在胃癌检测中的准确性。初步荟萃分析包括 42个数据集，包括基于人群的筛查研究，涉及 296,553 个人。包括来自亚洲（主要是日本）的多项研究。在评估胃蛋白酶原对胃癌检测的性能时考虑了 25 项研究。 合并胃癌的敏感性为 77.3%，特异性为 73.2%。另一项荟萃分析包括1520例胃癌 案例。结果表明，胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原II 检测癌症的汇总敏感性为 0.69，特异性为 0.73。

胃泌素17

最近提出了一个额外的标志物来表征胃窦部分的萎缩：胃泌素 17 (G-17)，因为它仅由器官这一部分的 G 细胞分泌。 当存在胃窦部萎缩时，G-17 水平预计会降低； 然而，萎缩的受试者的水平可代偿性增加 。 此外，循环中的 G-17 水平对生理刺激敏感，包括食物和药物摄入（例如质子泵抑制剂类胃药）。 这将检测胃窦部萎缩的测试值降低到远低于筛选测试可接受的灵敏度水平。 在近端和远端局部胃癌之间也没有发现 G-17水平的差异。 因此， 目前从研究该指标用于胃癌筛查的作用有限。

G-17 经常与胃蛋白酶原和幽门螺杆菌血清抗体检测联合使用。荟萃分析总结了在萎缩性胃炎中的研究结果，但不是针对胃癌检测的结果。 分析涉及 4241 名受试者，合并的敏感性为 74.7%，萎缩的特异性为 95.6%。

自身免疫性胃炎的标志物

自身免疫性胃炎患者发生胃癌的风险增加，因此建议识别这些人群并进行监测。 尽管自身免疫性胃炎的血清学检测在常规中被广泛使用，但目前还没有针对这种情况的无创检测策略的“金标准”。

胃壁细胞抗体(APCA)是质子泵 a 和 b 亚基的靶标，也被认为是胃粘膜萎缩的标志物。 胃壁细胞抗体被认为是自身免疫性胃炎的标志物，胃壁细胞抗体的存在与胃体部分的萎缩有关； 它们可能先于作为恶性贫血的胃体炎的临床表现。

内因子 (IF) 是由位于胃体和胃底的壁细胞（泌酸细胞）产生的糖蛋白。 抗内在因子抗体 (anti-IFA) 已被视为恶性贫血的标志物，出现在萎缩性胃炎的后期。 抗 IFA 似乎非常特异，但对萎缩性胃炎检测的敏感性较低。

因此，目前自身免疫性胃炎和相关疾病的诊断策略包括上述血清学标志物以及巨细胞性贫血的存在，检测低维生素 B12 水平、幽门螺杆菌状态和胃粘膜组织学评估。

新兴的基于血液的生物标志物

在过去的十年中，出现了各种其他基于血液的生物标志物检测，通常称为液体活检。 液体活检是用于分析癌细胞或癌细胞衍生分子的血液或其他生物流体样本。 它们是传统组织活检的一种非常有前景的替代方法，可用于癌症的早期检测和随后的预后、监测疾病进展和跟踪肿瘤演变。 液体活检中最常见的分析物是循环肿瘤细胞 (CTC) 和循环无细胞核酸，包括循环肿瘤 DNA、甲基化标志物、无细胞 mRNA、miRNA、lncRNA 和其他 RNA 种类。 最近，细胞外囊泡 (EV) 已成为液体活检的癌症衍生生物标志物的替代来源。

循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞是从原发性或转移性肿瘤脱落到癌症患者外周血中的播散性癌细胞。 它们可能以单个细胞或 2-50 个癌细胞簇的形式存在，并且代表血液转移的重要步骤。 虽然几项研究一致证明 循环肿瘤细胞 的计数和/或分子分析可用于预测 胃癌 患者的总体和无进展生存期以及监测治疗反应，但目前，它们与 胃癌 早期检测的相关性存在争议。 循环肿瘤细胞 是一种罕见且异质的肿瘤细胞群； 因此，不同的 循环肿瘤细胞 检测方法产生了不同的检测率。 多项研究表明，胃癌患者血液中的循环肿瘤细胞检出率和循环肿瘤细胞数量低于其他癌症 ，如前列腺癌或乳腺癌，从而构成了利用它们进行早期检测的生物屏障。研究人员使用 CellSearch 系统（美纳里尼硅生物系统公司，美国）发现，只有三分之一的可切除胃癌患者每 7.5 mL 血液中至少含有 1 个 循环肿瘤细胞。使用基于尺寸的分离技术，发现在 I 和 II 阶段的 胃癌 中，循环肿瘤细胞 检测率分别为 33.3% 和 50%。另一项研究表明，转移性疾病患者的循环肿瘤细胞 数量明显高于非转移性疾病患者，并且与晚期肿瘤分期相关。 同时，使用称为“FAST 盘”的离心微流体系统，该系统基于通过膜孔对 循环肿瘤细胞 进行大小选择性分离，在 >80% 的 T1 期和 N0 期 胃癌 患者中检测到 循环肿瘤细胞。使用基于过滤的方法，然后与上皮和间充质转录物的探针进行多重 RNA 原位杂交，表明在 胃癌 患者血液中发现的大多数 循环肿瘤细胞 具有间充质表型。 当同时计算上皮细胞和间充质细胞时，淋巴结阴性 胃癌的检出率为 77.3%，无远处转移的患者的检出率为 83.3%。 具有间充质表型的 循环肿瘤细胞 无法通过基于捕获表达上皮标志物（如 EpCAM 或细胞角蛋白）的细胞的方法检测到，因此在使用 CellSearch 系统或类似方法的研究中可能低估了 循环肿瘤细胞 的数量。 总之， 最新研究表明循环肿瘤细胞可能具有早期检测胃癌的潜在用途，捕获和分析异质循环肿瘤细胞群体的新方法值得进一步研究。

循环肿瘤DNA

DNA 片段从体内的各种细胞类型释放到循环中。 在癌症患者中，一部分无细胞 DNA (cfDNA) 来自肿瘤细胞，称为循环肿瘤 DNA (ctDNA)。 循环肿瘤 DNA 可用于检测肿瘤细胞中的体细胞点突变、重排、拷贝数变异和甲基化标志物，因此可用于癌症的非侵入性检测、监测治疗反应和疾病进展以及跟踪肿瘤内异质性和进化。 已在晚期和早期癌症患者中检测到 循环肿瘤 DNA，但是早期癌症患者 cfDNA 总库中循环肿瘤 DNA的比例通常很低，这代表了使用基于循环肿瘤 DNA 的主要技术挑战用于癌症早期检测的测试。 大多数分析循环肿瘤 DNA 的研究都使用基于 PCR 的方法或基于下一代测序 (NGS) 的方法。

液滴数字 PCR (ddPCR) 允许对生物流体样本中含有突变的 DNA 片段进行绝对定量，检测限低于野生型等位基因背景中 0.1% 的变异等位基因分数 (VAF) . 它是跟踪已知点突变和拷贝数变异的首选方法，例如患者的 HER2 扩增已经被诊断出患有胃癌。 然而，它需要对肿瘤突变情况的先验知识，因此它在早期检测或筛查方面的潜力有限。

相反，基于 NGS 的方法允许检测 循环肿瘤 DNA中的肿瘤特异性遗传或表观遗传改变，而无需事先了解肿瘤中存在的改变，因此对于检测癌症的存在和跟踪癌症的克隆进化，治疗或疾病进展期间的癌症具有潜在的相关性。然而，传统 NGS 方法的检测限约为 1% 的 VAF，当 循环肿瘤 DNA 比例相对较高时，这足以跟踪晚期疾病中的肿瘤突变，而如果 循环肿瘤 DNA 比例较低，则不适合。 因此，基于 NGS 的技术需要优化和改进以适用于早期癌症的检测。 最近，已经开发了几种用于检测可切除癌症的新型基于 NGS 的血液测试。

CancerSEEK 是一种血液检测，可以通过评估循环蛋白水平和 循环肿瘤 DNA 突变来检测八种常见的癌症类型，包括 胃癌。该检测在 1005 名患有卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、肺癌或乳腺癌的可切除 I-III 期癌症患者和 812 名 健康 个体中进行了测试。 结果显示，检测卵巢癌和肝癌的灵敏度为 98%，检测 胃癌 的灵敏度为 70% 左右，而特异性大于 99%。 重要的是，CancerSEEK 测试可以在 63% 的病例中正确识别癌症的解剖部位（并且在 83% 的病例中定位到两个可能的解剖部位）。

另一种最近开发的血液测试称为 PanSeer，它基于通过靶向亚硫酸氢盐测序检测 循环肿瘤 DNA 中癌症特异性甲基化模式。 该测试询问了 595 个已知包含差异甲基化 CpG 位点的基因组区域，这些位点可以将癌症与 健康 组织区分开来。 当应用于诊断后的血浆样本时，它可以检测五种常见的癌症（胃癌、食道癌、结直肠癌、肺癌或肝癌），灵敏度为 88%，特异性为 96%，而不管其来源如何。 此外，早期和晚期癌症的敏感性相似。 接下来，对 605 名无症状个体（其中 191 人在抽血后四年内被诊断出患有这些癌症类型之一）的检测显示，诊断前血浆样本的敏感性为 95%。 因此，这项研究表明，包括胃癌在内的常见癌症在使用标准护理方法进行诊断之前最多可以检测四年。

另一个必须考虑的方面是 cfDNA 中的一小部分遗传改变可能来自与年龄相关的克隆造血扩增。 为此，开发了一种策略来区分 循环肿瘤 DNA 改变和与克隆造血相关的变异。 来自 50 名可切除 胃癌 患者的匹配 cfDNA 和白细胞的靶向深度测序 (>30 000) 显示 62% 的患者存在白细胞衍生的序列改变。 重要的是，在 白细胞中最常受影响的基因是 DNMT3A (45%)、TP53 (29%)、EGFR (10%)、APC (6%) 和其他常见的癌症基因，这些变异的中位 VAF 为 0.31%，这类似于癌症特异性变异。过滤白细胞衍生的变异后，54% 的患者发现 cfDNA 中存在癌症特异性突变，这与手术后疾病复发密切相关。

总之，最近的研究表明，通过 循环肿瘤DNA 分析检测早期 胃癌 是可行的，并且最近开发的一些检测方法显示出非常高的灵敏度和特异性。 然而，必须去除源自 白细胞克隆扩增的混杂序列变异，以识别真正的癌症衍生序列变异，并且应在将此类检测整合到常规临床实践之前证明其临床实用性。

无细胞RNA

2008 年，一项原理研究证明， 表明 miRNA 从癌细胞释放到血流中，在那里它们受到保护，不会降解，并且很容易通过基于 PCR 的方法检测到 。 与此同时， 人血清中含有不同的疾病特异性 miRNA 模式，这些模式在 健康 对照中是不存在的，并表明几种疾病可能会在患者血液中留下特定的 miRNA 指纹 。 从那时起，在癌症患者的各种生物体液中研究了个体 miRNA 或 miRNA 特征的水平，并与疾病状态、阶段、侵袭性和对治疗的反应相关联。 大约一百篇出版物报道了在胃癌患者中检测循环无细胞 miRNA。 其中一些研究报告了 miRNA 面板的鉴定，显示出非常高的诊断价值。

然而，在多项研究中，少数 miRNA 显示出一致的结果，而许多其他 miRNA 的报道结果相互矛盾。 结果不一致和重现性差的主要原因是队列规模小、前瞻性研究缺乏验证、RT-qPCR 结果的不同归一化方法以及血液样本收集和处理的可变条件。

最近，发表了一项广泛的三阶段研究，以解决早期研究的缺点。在第一阶段，通过 RT-qPCR 在 236 个 胃癌 病例和 236 个匹配的对照受试者中量化了 578 个候选 miRNA。 在第二阶段，在 AUC 为 0.92（I-II 期 胃癌 的 AUC 为 0.91）的两个独立病例对照队列中，选择并验证了一组显示最高 AUC 的 12 个 miRNA，分别为 89 和 121 名受试者。 最后，在 4566 名参与者的前瞻性验证队列中制造并验证了临床级 12-miRNA 检测，这些参与者接受了胃镜检查和基于血清的 胃癌 检测生物标志物测试（幽门螺杆菌血清学、胃蛋白酶原 I/II、Pg 指数、CEA 和 CA19-9）。 12-miRNA 面板将 胃癌 与 健康 对照区分开来，AUC 为 0.848（灵敏度为 87%，特异性为 68.4%），而其他生物标志物测试显示 AUC 范围为 0.647（ABC 方法）至 0.576（Pg 指数和 CEA）。 因此，该检测明显优于目前可用的测试，并且有可能用作胃癌 的风险评估工具和高风险人群的筛查工具。

此外，许多研究 探索 了使用其他 RNA 种类的可能性，例如 mRNA、长链非编码 RNA (lncRNA)和环状 RNA (circRNA)作为基于血液的胃癌 的生物标志物。 其中一些研究已经确定了显示出与上述 miRNA 面板相似的诊断性能的 RNA 生物标志物特征。 例如，剖析lncRNA 在匹配的术前和术后血浆、5 名 胃癌 患者的肿瘤和正常胃组织中的 lncRNA 的检测结果导致 5-lncRNA 指数的鉴定，随后在 321 名受试者中进行了测试，可用于区分 胃癌 和 健康 对照，激用于区分 胃癌 和癌前病变。 手术后 lncRNA 指数下降，表明血浆中这些 RNA 的主要来源是肿瘤组织，该指数适用于监测肿瘤动态。 综上所述， 这些研究提供了一个原理证明，即各种编码和非编码 RNA从癌组织释放到血液中 ，但是，需要进行大型前瞻性临床研究并与现有生物标志物进行比较，以评估其临床效用。

细胞外囊泡

“细胞外囊泡”是指从细胞自然释放到细胞外空间的各种膜结合囊泡，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。 细胞外囊泡 包含各种蛋白质、脂质、代谢物和各种编码和非编码 RNA，甚至 DNA 片段。 在包括 胃癌 在内的各种癌症患者的生物体液中发现 细胞外囊泡 水平增加，但仍不清楚这些 细胞外囊泡 是由癌细胞本身产生还是代表对疾病或治疗的全身反应。 此外，在患有各种非癌症疾病和生理应激状况的患者的血液中发现细胞外囊泡水平增加，因此细胞外囊泡 水平本身似乎不是癌症的高度特异性生物标志物。 细胞外囊泡 可能是液体活检中癌症衍生生物标志物的来源。 细胞外囊泡可能比循环肿瘤细胞、ctDNA 或基于 cfRNA 的液体活检有几个优势：(i) 细胞外囊泡比循环肿瘤细胞更丰富，因此可能比循环肿瘤细胞更好地反映肿瘤内异质性； (ii) 它们保护其货物免于降解，因此可能是比总血浆或血清更稳定的 cfDNA 和 RNA 来源，以及 (iii) 它们包含让人联想到其亲本细胞的分子特征，并且可能富含低丰度但高度特异性癌症生物标志物。

总结：

不推荐传统的肿瘤标志物（如 CEA、CA 19-9、CA 72-4 等）作为独立检测指标用于早期胃癌非侵入性检测。

研究最多的胃癌前病变标志物是胃蛋白酶原（Pg I、Pg I/II），然而，这些不能被视为癌症检测，但可用于识别监测风险增加的人群。 应该对癌前病变的检测进行额外的研究，以提高敏感性。

基于癌症特异性甲基化模式、循环蛋白和循环肿瘤 DNA 突变以及 多种组合miRNA 面板检测的方法已经证明了有希望的结果，使这些更接近实践，而基于循环检测的测试肿瘤细胞、细胞外囊泡和无细胞 RNA 需要更广泛的研究。

总之，对于胃癌或高风险癌前病变的完美检测方法的需求尚未得到满足，需要更多的研究来满足这一需求，目前早期胃癌的诊断还是需要靠胃镜检查来明确，其他方法并不可靠。

原文链接： Huilin Shao, Hyungsoon Im, Cesar M. Castro, Xandra Breakefield, Ralph Weissleder and Hakho Lee. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles. Chem Rev. 2018 Feb 28118(4):1917-1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534.

该综述发表在Chemical Reviews杂志上，影响因子高达54.301分，对细胞外囊泡的研究方法总结非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，这篇综述都有介绍，十分详尽！通讯作者是哈佛大学的Hakho Lee教授。

Extracellular Vesicles (EVs) 细胞外囊泡是由细胞主动释放的多样的纳米级膜囊泡。类似大小的囊泡可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类(如外泌体、微囊泡)。虽然EVs最初被认为是细胞碎片，因此未被重视，但现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信和疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体。

该综述的内容包含：

生物流体（Biofluids）中含有大量的EVs，这些EVs可以从Parental Cells转移不同的分子去其他细胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。

EV的形成决定了其膜组成。

微小囊泡的膜组成最能反映其Parental Cells(母细胞)的质膜。

相反，外泌体中已经鉴定出特异性的内体蛋白分子，这反映出外泌体形成的机制。内体分选复合物（ESCRT）已被广泛认为用于调节和引导特定分子进入MVB的腔内囊泡。ESCRT及其四个主要复合物（ESCRT 0，I，II和III）负责传递泛素化蛋白，用于溶酶体降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改变外泌体的蛋白质含量和细胞释放外泌体的速率。更有趣的是，发现外泌体富含ESCRT系统的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌体识别的标记。

ESCRT不是介导外泌体形成的唯一机制。其他不依赖ESCRT的过程似乎也能以相互交织的方式参与其形成和分泌。外泌体也富含ESCRT非依赖性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被证明参与内体小泡运输。小GTP酶的Rab家族参与小泡运输和与质膜融合表明这些蛋白在释放外泌体中的作用。另外，外泌体中神经酰胺水平升高，抑制鞘磷脂会引起的外泌体释放减少，表明鞘磷脂酶与囊泡释放有关。

外泌体和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非编码RNA。自从最初发现EV含有RNA，人们一直非常关注EV RNA用作诊断生物标志物。在开创性的工作中，Skog等人发现胶质母细胞瘤患者的血清外泌体含有特征性的突变mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供诊断信息。这些核酸的发现导致了这样的假设，即EVs可以在细胞之间转移遗传信息。确实，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有转移进入宿主细胞后仍然可以翻译的mRNA。EV中也有逆转座子和其他非编码RNA的表达。逆转录转座子序列和miRNA以及可翻译的mRNA都通过EV进行转移，这些成果突出了EVs作为遗传信息的载体和传播者的重要性。

虽然传统的光学显微镜的衍射极限接近EV的大小，但是不能产生清晰的图像。高分辨率EV图像需要通过电子显微镜(EM)或原子力显微镜(AFM)得到。然而，这些方法的通量有限，因为需要专门的染色方案和设备。

（a）扫描电子显微镜（SEM）提供三维的表面拓扑信息。

（b）透射电子显微镜（TEM）具有出色的图像分辨率，可结合免疫金标记一起使用来提供分子表征。

（c）冷冻电镜（cryo-EM）无需大量处理即可分析EV形态。

动态光散射 (DLS)，也称作 光子相关光谱 或 准弹性光散射 ，是一种物理表征手段，用来测量 溶液 或 悬浮液 中的 粒径分布 ，也可以用来测量如高分子浓溶液等复杂 流体 的行为。当光射到远小于其波长的小颗粒上时，光会向各方向散射（ 瑞利散射 ）。如果光源是 激光 ，在某一方向上，我们可以观察到散射光的强度随时间而波动，这是因为溶液中的微小颗粒在做 布朗运动 ，且每个发生散射的颗粒之间的距离一直随时间变化。来自不同颗粒的散射光因相位不同产生建设性或破坏性干涉。所得到的强度随时间波动的曲线带有引起散射的颗粒随时间移动的资讯。动态光散射实验易受灰尘或杂质影响，故样品的 过滤 和 离心 十分重要。

动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。

动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。 小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。

在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是动态光散射技术由于是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。

纳米粒子跟踪分析(NTA) 是一种光学粒子跟踪方法，用于确定粒子的浓度和大小分布。用光束照射样品中的粒子。当粒子散射光并经历布朗运动时，摄像机记录下每个粒子的路径以确定平均速度和扩散率。与DLS的体散射测量不同，NTA跟踪单个粒子的散射。

然后，此信息将用于数学计算浓度（即视野中的粒子数量）和尺寸分布（即通过Strokes-Einstein方程的流体动力学直径，图5b）。 为了准确定量异质囊泡的浓度和大小，NTA程序需要精确优化摄像头和分析设置。 可能需要使用不同设置进行单独测量，以获取异质混合物中EV子集的准确读数。

EVs在大小、起源和分子组成上都是异质性的；除此之外，它们还存在于不同的复杂的生物流体中，包括血、胸腔积液、腹水、乳汁、唾液、脑脊液和尿液。这些流体中还含有大量的非囊泡大分子结构，可能会干扰EV的分析。所以EV的分离和富集显得尤为重要。

超速离心法（80%）和密度梯度离心法（20%）是最常见的两种高通量混合分离法。根据它们分离机制，这些方法可以分为三大类:密度、亲和和大小。

用不同的离心力将颗粒分离:以较低的离心力(300g)去除细胞碎片，而以较高的离心力(100000g)对EV进行沉淀和浓缩。尽管该方法是应用最广泛的金标准，但它也有许多缺点，如体积大、仪器昂贵、处理时间长、过程繁琐、被聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染以及需要大量的样品。

蔗糖梯度离心法是一种更为严格的超速离心法，它有助于进一步分离不同密度的囊泡，通常用于分离外泌体(悬浮密度为1.15至1.19 g/mL)。在这种方法中，一个包含不同大小囊泡和大分子的样品在一个密度从上到下递增的梯度表面上被分层。在离心过程中，不同的分子以不同的速率通过梯度沉积。由于其分辨率更高，该方法被认为可以分离更高纯度的EVs(特别是外泌体)；然而，它面临着许多与超速离心法相关的限制。更加新的等渗梯度(如碘黄醇梯度)法被认为效果更好。

最近，基于聚合物共沉淀法的商业试剂盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被开发用于EV富集。这些试剂采用降低EV的水合作用(从而降低溶解度)导致沉淀，然后在低离心力的情况下，沉淀的EV产物可以很容易地、重复性地分离出来，从而避免了长时间的超速离心法操作。然而，这些试剂盒对于大规模使用来说是昂贵的，而且对于EV来说缺乏特异性。该方法还容易产生非均相聚合物颗粒。由于这些试剂均降低了EV和蛋白质的溶解度，因此该方法还可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA复合物。因此，共沉淀法作为EV分离方法受到了限制。

大小排阻色谱法根据它们的分子大小通过凝胶过滤来分离囊泡和其他分子。这种凝胶由含有特定大小分布孔隙的球形珠组成。当样品进入凝胶时，小分子扩散到孔隙中，而大分子则直接洗脱。因此，大分子比小分子更早地离开色谱柱，这使得分子的停留时间与色谱柱的大小相关联成为可能。近年来，该分离方法已被应用于从复杂的生物媒介中分离纯化囊泡。Sepharose, GE HealthcareqEV, iZon等商业公司也正在开发商业的产品以简化EV富集，这些产品的排除柱都大约是75纳米孔径的树脂。蛋白质和其他较小的污染分子被滞留在孔径中，而较大的囊泡(>75 nm)可以迅速通过并在空隙中被洗脱。大小排阻法可将EV与可溶性蛋白分离；为提高分离的效率和分辨率，需要考虑多种因素，包括介质类型、孔径、EV与介质之间的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。

为了提高复杂生物流体的EV分离效率和特异性，人们开发了多种新的EV富集方法。然而，与传统方法相比，这些新方法中的大多数具有较低的吞吐率，应加以解决使之变得实用。

基于分子大小的分离是一种很有潜力的方法，可以将EV与大型细胞碎片分离开来。各种微流体过滤系统已经被开发出来，用于从大的细胞碎片和蛋白质聚集物中分离EV，这些系统大部分是基于分子大小差异。例如,Rho等人构建了一种微流控设备，该设备使用膜过滤器对未处理的血液样本进行筛选，来分离EV。膜过滤器的大小∼1μm。在膜的下方插入一个毛细管，用于引导过滤后的EV进入收集通道。膜过滤器和毛细管导向器夹在两个环形磁铁之间；这种设置在进行大量的样品处理时可以方便地更换过滤器集。

Lee等人最近使用声波以无接触方式对EV进行细分。这种分离利用超声波驻波，根据囊泡的大小和密度对其施加不同的声交互作用力。该装置由一对相互交错的换能器(IDT)电极组成，用以产生跨流动通道的驻波表面声波。

EV蛋白主要来源于胞质膜、胞质醇，而非其他胞内细胞器(如高尔基体、内质网、细胞核等)。EV蛋白质的构成提示了囊泡的生物发生和cargo sorting(这个翻译有点怪)。因此国际细胞外囊泡组织建议应该仔细鉴定EV蛋白，特别是跨膜蛋白和胞质蛋白。

在哺乳动物中，跨膜蛋白和脂质结合的细胞外蛋白(如内贴蛋白)都与微囊泡和外泌体有关。外泌体的跨膜蛋白富含四聚体蛋白(如CD9、CD63和CD81)一个具有四个跨膜结构域的蛋白质超家族。四聚体蛋白参与细胞膜的转运和生物合成的成熟，在外泌体中高表达，这一特性使得四聚体蛋白被用于外泌体的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚体蛋白并不只在外泌体中唯一表达。另一方面，微囊泡富含整合素、选择素和CD40配体，表明它们来自于细胞的质膜，EV富含特异的跨膜蛋白受体(如表皮生长因子受体/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮细胞黏附分子/EpCAM)。由于许多跨膜蛋白参与了正常生理和疾病的发病机制，它们被用作重要的病理生理学EV生物标志物。

EV相关的囊内蛋白具有多种功能。它们包括具有膜或受体结合能力的参与囊泡运输的胞质蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV还富含细胞骨架蛋白(如:内酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侣蛋白(如:热休克蛋白/HSPs)、代谢酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶/GAPDH和核糖体蛋白)。有趣的是，最近的研究发现EV蛋白可以被受体细胞有效地运输和接收，从而在体内和体外引起强烈的细胞反应。这带来了EV作为治疗和药物载体的新机遇。

EV蛋白的定量和特征鉴定不仅对阐明EV的生物发生和cargo sorting有重要意义，而且对鉴别生理和病理标志物也有重要意义。然而，传统的蛋白质分析，包括Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)，通常需要大样本量、大量处理和/或庞大的专门仪器，因而不太适合临床应用。

在EV蛋白评估时，Western blotting可能是最常用的技术，用于提示与EV相关的靶蛋白的存在。在这个过程中，纯化的囊泡制剂(通常通过现行的梯度超离心法金标准制备)可以用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲裂解液进行处理。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)分离蛋白裂解物，然后转移到膜上，对特定的蛋白target进行免疫印迹。虽然这种方法有很长的准备和处理时间(>10h)，但是Western blotting可以提供关于蛋白质分子大小的有用信息。

不像Western blotting，ELISA只能在相对较小的范围内对目标蛋白进行定量，质谱分析可实现高通量肽谱分析。纯化的EV制剂经过酶消化和肽分离，然后用质谱仪电离分析。在这个复杂的过程中，多个步骤严重影响EV蛋白组学分析。除了有效的EV纯化，质谱分析之前的肽分馏被认为是鉴定囊泡蛋白的一个重要前提。通常通过三种主要方法实现：(1)SDS−PAGE，(2)二维液相色谱和(3)基于等电聚焦的分馏。

值得注意的是，既然质谱分析可以鉴定消化后的肽片段，那么适当的蛋白质鉴定、定量和验证是必要的。已经有两种用于定量的技术方法：基于标签的和无标签的。在基于标签的定量分析中，标签(等压或同位素)被用于比较分析。无标签的定量分析中，色谱强度的谱计数被应用。识别出的候选蛋白可以使用其他传统的蛋白质技术如Western blotting进行验证。在检测灵敏度方面，质谱法通常不如基于抗体的技术敏感。

虽然质谱分析需要大量的准备和处理时间(数天)，但它可以提供高通量、定量和EV比较蛋白质组分析。到目前为止，已有成千上万的囊泡蛋白被系统分类，蛋白质-蛋白质相互作用分析。基于质谱的哺乳动物和细菌EV的蛋白质组学分析的详细讨论已经在一些综述中被强调。这些网络和相互作用的研究有助于阐明EV载体的功能活动及其在细胞间远距离通信中的重要作用。

为了解决EV蛋白质定量相关的技术挑战，新一代生物传感器正在开发中。与传统的蛋白质检测方法相比，这些生物传感器利用独特的传感机制，可以检测各种大小和分子含量的EV。这些技术中的许多只需要更小的样本量和更少的样本处理过程，因此非常适合于医疗应用。

流式细胞术是一种基于光散射和荧光激活来分选单个大颗粒(如细胞或微米大小的实体)的强大的技术，然而，传统的流式细胞术对检测直径小于500 nm的小颗粒的灵敏度和分辨率有限。此外，它还受到高光学背景的影响，由于鞘层流体中存在小颗粒(约200 nm)。用传统流式细胞术量化EV时，大量的小EV可能被忽略或者计数偏低：可能同时有多个小的囊泡被照亮被计数成一个单独的事件，这种现象被称为“群体理论”。

为了解决传统流式细胞术的弊端，微米大小的乳胶珠被用来绑定多个囊泡。然后用荧光抗体对结合的EV进行染色，并对其蛋白标记物进行鉴定。然而，这种方法缺乏分析单个囊泡的能力，并且不能区分不同的囊泡亚群，这可能会导致特征的丢失。

该技术主要基于磁性纳米粒子(MNPs)。由于大多数生物物质天然缺乏铁磁背景，这种传感几乎不受同系统中其他生物样品的干扰。因此，即使光学上浑浊的样品对磁场也是透明的；当靶分子被特定的MNPs靶向时，它们与自然的生物背景形成了强烈的对比。在基于核磁共振(NMR)的磁检测中，MNPs置于NMR磁场中，产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫率，放大分析信号。因此，核磁共振减少了样本处理过程，提高了检测灵敏度，已经被开发用于多个医疗点应用(例如，直接从血液样本中检测循环肿瘤细胞和细菌)。

但是将这种技术运用在EV检测上却遇到了挑战，因为EV明显比肿瘤细胞小1到2个数量级。Shao等人开发了一种专门用于EV检测和蛋白质分析的新分析技术。此方法采用两步生物正交点击化学方法来标记EV，这种小分子(<200 Da)标记策略并没有显著增加抗体或MNP的大小，从而提高了从非结合抗体和MNPs中保留目标囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μNMR)直接测量EV来确定EV生物标志物的丰度。

相比传统的蛋白技术，μNMR系统表现出更好的检测灵敏度：比WB和ELASA灵敏10 3 倍。Shao等人利用这种集成技术可研究在培养皿中生长的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系中的EV。比较蛋白分析证实，EV确实反映了其亲代细胞的蛋白概况，组合GBM的四种标志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)

R132H)可用于区分癌症来源的EVs与宿主细胞来源的EVs。

鉴于EV的尺寸小，一种新的快速无标签EVs检测方案：表面等离子体共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金属介电界面上传导电子的集体振荡。不同于其他基于时敏荧光和化学发光探针的光学检测方法，SPR传感检测金属-介电介面附近生物分子结合相关的局部折射率变化，应用于无标签和实时检测。

RNA是EV携带的主要核酸。与细胞中的RNA相比，eEV运输的RNA通常更短(通常<200个核苷酸，但也有长达5 kb的)。它们主要是非编码rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、长链非编码RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。编码mRNA (mRNA)已在长度为200~1000个核苷酸的转录组中被识别。mRNA可以翻译成蛋白质，而miRNA可以调节受体细胞中靶mRNA的翻译。EV中RNA的数量和性质可以根据其来源的细胞类型而变化。

由于它们在受体细胞中保留了功能，研究人员提出了有趣的假设，即可能存在专门的机制将不同的RNA分配给EV运输到特定的受体细胞，或可能利用这些机制运送治疗性RNA到特定的部位。这是一个活跃的研究领域，已经有一些综述对其进行阐述。

近年来的研究发现，EV中含有相当比例的母细胞的mRNA，其中许多是细胞特异性的mRNA。这些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保护其不被RNA酶降解，使它们成为强有力的循环生物标志物。

此外，已在多个研究中得到证实：EV中一些<2 kb的mRNA分子能够编码支持蛋白质合成的多肽(即，蛋白质翻译的功能)。这些研究强调了EV作为特定的细胞信使在影响受体细胞和促进细胞间通讯等多方面的作用。

miRNA是一类小的非编码rna(一般为17 - 24个核苷酸)，通常通过靶向mRNA的3’非翻译区介导转录后基因沉默。通过抑制蛋白质的翻译，EV miRNAs在许多生物过程中都是强有力的调控因子。不同于EV中的循环mRNA，miRNA可以以多种稳定形式存在于体液中。除了被包裹在EV中，循环miRNA还可以被加载到高密度脂蛋白或结合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的证据表明，虽然大多数循环miRNA都与RNA结合蛋白相结合，但在EV中也能发现少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。与mRNA的情况一样，EVs中的miRNA表达反映了其细胞来源，但与亲代细胞略有不同。一些miRNA已被发现优先表达在EV中，并在受体细胞中保持功能以调节蛋白翻译。最近的研究还发现，在哺乳动物细胞培养中常用的胎牛血清可能在体外EV制备过程中导致miRNA伪影。

通过NGS，我们还发现有其他类型的RNA存在EV中。这些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及长链非编码RNA (lncRNA)。参见上表。

最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。这些DNA是双链片段，范围从100个碱基对(bp)到2.5 k bp，EV外部还有一些与之相关的>2.5k bp的DNA片段。这些片段代表整个基因组DNA，可用于鉴定亲代肿瘤细胞中存在的突变。虽然有可信的证据表明在EV中存在DNA，但其功能尚未确定。

EV核酸作为一种潜在的循环生物标志物和受体细胞间的调节因子已被广泛研究。传统的核酸提取和分析工具已经成功地为我们理解EV核酸奠定了重要的基础。由于EVs中核酸的含量较低，开发高效的提取方法和灵敏的检测策略是非常重要的，特别是在小样本中对稀有目标分子进行检测。

随着人们对利用EV核酸作为微创诊断标记的兴趣日益浓厚，新的生物传感器技术已被开发出来，使提取和分析变得更加高效、快速。这些新平台中有许多提供了对目标核酸标记的敏感定量，并且能够在复杂的生物学背景下识别疾病标记，甚至包括单核苷酸点突变。这为个性化临床医疗开辟了许多新的机会。

虽然传统PCR是检测基因/转录突变的强大技术(例如，EGFRvIII缺失突变)，但其敏感性有限，其在检测单核苷酸突变方面存在很多不足。这个问题与EVs特别相关，因为在野生型转录本的大背景中，突变转录本的比例很低。Chen等人最近采用了一种液滴数字PCR (ddPCR)技术来检测EV中的罕见突变。

Shao等人最近开发了一种综合微流控平台，用于现场EV核酸分析，该平台集成了三个功能模块：靶向富集EVs，芯片上RNA分离，实时RNA分析。这个平台被称为免疫磁性外泌体RNA(iMER)分析平台：利用抗体功能化的磁珠从宿主来源的囊泡中分离癌症特异性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。当EV裂解液通过玻璃珠过滤器时，选择性吸附EV RNA并从过滤器中洗脱，用于反转录和qPCR分析。为了简化分析过程，所有关键部件都集成到一个芯片盒中。

随着该系统的发展，作者研究了核蛋白的两个mRNA靶标，MGMT(6-甲基鸟嘌呤)

肿瘤是一种复杂的结构，包括恶性细胞和周围的基质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。最近的研究表明，EVs在肿瘤微环境中促进细胞间通讯，从而调节疾病的发生、发展，并且在治疗反应方面发挥重要作用。

这一大块儿的其他内容大家感兴趣的话可以阅读原文献。

在大多数神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆)中存在类似的疾病进展模型，其中错误折叠的蛋白质自结合形成有序的聚合体并在细胞中聚集。阿尔茨海默病(AD)中，淀粉样蛋白的Abeta肽的形成可能是这些蛋白聚合体中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一种类型的聚合体在细胞内形成，主要由alpha-synuclein(突触核蛋白)组成，称为路易小体。最近的研究表明，许多神经退行性疾病中涉及的错误折叠蛋白出现在EV中。因此，这些囊泡为检测和监测神经退行性疾病带来了新的希望。

AD是一种迟发性神经系统疾病：由于神经变性而导致记忆和认知能力的逐渐丧失。虽然AD的确切病因仍是一个有争议的话题，但很明显，与Aβ肽相关的斑块沉积和与tau蛋白相关的神经纤维缠结对疾病的进展是非常重要的。这些淀粉样肽来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解过程。这一

外泌体和微囊泡是几乎所有类型的细胞都能释放的细胞外囊泡(ev)的两大类，在生物液体中非常丰富，ev的分子组成和释放都被认为是受到外界刺激的严格调控的。多项研究一致表明，ev可以在不同的细胞类型之间转移蛋白质、脂质和RNA，从而介导细胞间的通信和信号转导。重要的是，ev中的小非编码rna被认为是在受体细胞中发生的分子事件的主要贡献者。

此外，外泌体和微囊泡中的RNA可以作为多种疾病的非侵入性的生物标志物，包括免疫系统的病理变化。

这篇综述旨在提供ev相关RNA转录组领域的最新技术，以及对以往使NGS测序来描述不同细胞释放的ev中RNA含量的研究进行全面分析。最后，我们强调了与获得纯EV和 EV相关RNA的深度测序 相关的技术挑战。

细胞外囊泡分为三种类型（ classifified by their origin and biogenesis）：apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs, also known as shedding vesicles), and exosomes。

大肿瘤小体(LOs)已被确定为第四种类型的ev，它是由肿瘤细胞脱落的膜泡产生的，其大小与 ABs相似。

它们直径大小不一，包含物也有所差异：MVs和外泌体包含各种细胞质和膜解蛋白以及脂质、糖和核酸（9），而ABs可能还包括核组分和细胞器。

marker特征差异：外泌体特征良好的蛋白标记物包括各种四酯蛋白，如CD9、CD63和CD81；而mv包含质膜常见的跨膜蛋白，如整合素和选择素；同时，ab可以通过组蛋白的存在来区分。

在多种早期RT-qPCR技术以及最近的报道中，外泌体和MV中的mRNA、miRNAs和lncRNAs得到了一致的证实。更先进的高通量RNA测序方法的应用揭示了，从生物液体和细胞条件培养基中分离的ev亚群中存在各种其他RNA种类。

这些RNA种类包括snRNA、snoRNA、piRNA、vault RNA、Y-RNA、scRNA、SRP-RNA和7SK-RNA；以及来自rRNA、tRNA、mRNA、lncRNA和各种基因间重复序列的短片段。

TABLE 1 | 使用高通量测序显示EV转录组含量的报告

Nolte-‘tHoen等人通过高通量测序研究了培养过程中免疫细胞释放的EV中的小RNA含量。从EV中分离出的总RNA大部分是小RNA (<200 nt)，含有少量的18S和28SrRNA。这些短RNA片段主要定位于蛋白质编码区和基因组重复序列，包括SINE、LINE和LTR序列。相反，细胞小RNA群体中存在的大部分序列代表miRNAs，而细胞分泌的EV中miRNAs的比例显著较低。

除了编码mRNA和重复序列的蛋白质外，EV组分还包含所有类型的结构RNA(如vaultRNA、Y-RNA、snRNA、snoRNA、SRP-RNA和tRNA)以及来自lncRNA和假基因的片段。

此外，相对于细胞RNA来说，许多小非编码转录本在EVs中富集，这表明细胞可能选择特定RNA进行细胞外释放。

许多其他研究也证实，由各种培养细胞释放的外泌体中，miRNA 的表达明显低于其他种类的 RNA，这些数据与先前的观察结果一致，即大多数个体外泌体不携带任何生物学上有意义的 miRNA 拷贝。然而，其他的 RNA 测序实验表明，一些细胞系释放的外泌体中相当大比例的小 RNA-seq reads仍然与 miRNA 相对应。

有趣的是，几个独立的小组观察到有15-50% total reads RNA 片段比对到包括逆转录病毒序列，LTR，SINE，和 LINE 序列的基因组重复序列。需要指出的是，作者并没有明确说明在上述研究中使用的小 RNA 文库制备方案是否包括允许捕获5′-OH 和/或3′-磷酸化 RNA 的修饰。因此，目前尚不清楚他们是否真的在相应ev中表征了小RNA的全谱特征。

Jenjaroenpun 等人和 Miranda 等人分别报道了在 MDA-MB 细胞培养液和尿液 EVs 中总 rna (包括长 rna 和小 rna)的测序，并显示了相当比例的 rRNA 读数(87-97%) ，与细胞质中的 rRNA 含量相似。在剩下的3-13% 的片段中，大约一半被标记为蛋白质编码转录本，另一半则标记为非编码 rna 和基因组重复序列。

在Beradrocco等人的另一篇报道中，作者分别使用total RNA和sRNA测序protocols来表征四种不同肝癌细胞系释放的EV中封装的长RNA谱。总RNA片段比对到rRNA的比例最大(32-66%)，而基因组重复序列的比例为15-44%，只有11 -25%的片段映射到蛋白编码和非编码RNA基因。对相同EV制剂进行的sRNA测序显示，RNA类别的分布略有不同:rRNA(16-54%)、基因组重复序列(24-40%)和转录组(24-51%)。

在另一项与small RNA测序相平行的全转录组RNA-seq研究中，Lasser等人证实，人类mast和红白血病细胞系释放两个外泌体群体(通过密度梯度浮选分离为HD和LD组分。在HD和LD部分中，长和短RNA cargo明显缺乏相关性，这表明这两个部分的细胞外RNA与不同的通路相关。与LD外泌体相比，HD中mRNA转录本的reads比例更丰富(75 vs. 20%)，而非编码RNA的分布则相反(25 vs. 80%)。 在 short RNA libraries，HD部分富集成熟miRNA(23%)，而LD部分主要是tRNA(28%)和成熟miRNA(10%)。

另一项研究研究了黑色素瘤细胞在培养过程中释放的三种不同EV类型的RNA含量，并确定了一些非编码RNA在每个EV样本中富集。RNA图谱表明，在相对中等水平的sRNA水平的ABs和MV中存在显著的18S和28S rRNA峰。相比之下，外泌体主要包含小RNA，与ABs和mv相比rRNA更少。尽管EV亚群的miRNA装载量与外泌体略有不同，但大量的miRNA仅在外泌体中被检测到，而在ABs和MV中均不存在，这支持了外泌体富集特异RNA的概念。必须指出的是，与miRNA相比，其他ncRNA种类不仅显著丰富，而且选择性富集在黑素瘤细胞释放的不同EV亚型，这增加了研究细胞外囊泡RNA货物及其功能的复杂性。

到目前为止，只有少数报道对从人类生物液体中分离的EV中的小RNA货物进行了下一代测序。这些研究表明，从人血浆、唾液和尿液中分离出的外泌体含有相当比例的miRNA reads(35-76%)。

上述生物流体EV中其余的RNA种类包括rRNA、lncRNA、tRNA、mRNA、重复区域以及小的非编码RNA如piRNA、snRNA、snoRNA等。值得一提的是，与“几天”细胞条件培养基相比，从生物体液中分离出的外泌体可能含有大量的大蛋白聚集物，包括通常在细胞死亡时释放的装载mirna的AGO复合体。因此，在人类体液中检测到的miRNAs是否确实与ev相关仍有待验证。

有趣的是，对尿液外泌体纯化的总RNA进行深度测序发现，其转录本分布与Cheng等人(48)观察到的完全不同。具体来说，大部分(约87%)的RNA reads被映射到rRNA上，只有约8%的reads被映射到非编码RNA和DNA重复序列上，而剩下的约5%对应于蛋白质编码RNA。相反，Miranda等报道的图谱统计和reads分布与细胞条件培养基中外泌体的总RNA测序结果相似。

综上所述，从上述研究演变而来的集体证据(表1)认为，大多数细胞释放的EV确实携带大量的非编码转录本和蛋白质编码转录本，以及它们的部分，在研究细胞外RNA对受体细胞的影响时应该考虑这些。

EVs RNA载物含量的差异可能部分是因为:

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