为什么用插片法或塔片法

搭片法：主要用于观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等，方法简便。插片法：可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

注意事项：

1、倒平板要厚一些，接种时划线要密。2、插片时要有一定角度并与划线垂直。3、观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。4、如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。

放线菌细胞的结构与细菌相似，都具备细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核等基本结构。个别种类的放线菌也具有细菌鞭毛样的丝状体，但一般不形成荚膜、菌毛等特殊结构。放线菌的孢子在某些方面与细菌的芽孢有相似之处，都属于内源性孢子，但细菌的芽孢仅是休眠体，不具有繁殖作用，而放线菌产生孢子则是一种繁殖方式。

一、细菌制片及简单染色：

1、涂片

取洁净的载玻片1张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一滴无菌水，用接种环在火焰旁从培养基上挑取少量菌体与水混合。用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。注意，取菌量不宜过大，一面造成军体重叠。

2、干燥

放在桌面上，待其自然干燥。

3、固定

将已干燥的涂片标本向上，在火焰上通过3-4次固定。其目的是杀死细菌；使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载玻片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结合力，使图片易着色。

4、染色

在涂片上滴加染料1-2滴，使其布满涂菌部分，染色1分钟。

5、冲洗

斜置玻片，倾去染液。用水轻轻冲去染液，至流水变清。注意水流不能直接冲洗涂菌处，以免将涂菌冲洗掉。

6、吸干

用吸水纸轻轻吸去玻片上的水分，干燥后镜检。

二、酵母菌制片及简单染色。

水—碘液浸片法。将革兰氏染色用碘液用水稀释4倍后，滴加一滴于载破片中央，无菌操

作取少许菌体置于染色中混匀，盖上破片后镜剑。

三、放线菌制片方法（插片法）

1、在马铃薯浸汁琼脂培养基平板上，划线接入少量放线菌的孢子，在接种线旁倾斜地插入无菌盖玻片，于28-30℃培养。

2、培养3～4天后，菌丝沿着盖玻片向上生长，待菌丝长好后，取出盖玻片放在干净的载玻片上，置于显微镜下观察。

四、霉菌制片法

水浸制片法：

1、在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水。

2、用解剖针从生长有霉菌的斜面挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。（也可省略酒精和水浸润，洗涤）

3、注意取菌时，毛霉和根霉用解剖针挑取少量菌丝即可，青霉和黑曲霉和培养基结合紧密，不易挑取，可连培养基一起挑取，再在染液中分离菌丝。青霉和曲霉的培养时间不宜过长，一般为2-2.5天，以免菌丝与培养基不好剥离。

4、盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）。（黑曲霉不易观察到足细胞）

5、镜检：先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。

取样，戊二醛等固定液固定，酒精梯度脱水，冷冻干燥or二氧化碳临界点干燥，喷金或蒸碳。

以上四个步骤，根据所使用的SEM成像的真空模式，可以有所省略。

如果用ESEM，取样后可直接放入样品室，在一定“环境真空”下进行观察；如果采用LV模式，直到干燥，可以免喷金；高真空模式，必须做到喷金等样品导电处理。

具体可到公益网站：中山大学生物电子显微学实验室网站查询

扫描电镜样品制备: 基础课程，生物样品因含水，其样品制备有其特殊性。

http://bioem.sysu.edu.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5

有时候公益网站有点那个，不好点开，请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/

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