如何正确绘制血清醋酸纤维薄膜电泳图谱

如何正确绘制血清醋酸纤维薄膜电泳图谱,第1张

人体中含有的各种血清蛋白执行着许多特殊的功能。在各种疾病期间总血清蛋白浓度和各蛋白质组分的比例可发生变化,因此,血清蛋白质和各蛋白质组分的定量在临床诊断和治疗上有很重的价值[1]。“血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳”实验因而是《生物化学》学科实验项目中最常开设的基本实验项目之一,该实验的开设有利于帮助学生更进一步了解血清蛋白质的基本组分及正常含量。但是,电泳分析由于手工比重较大,技术人员的经验和手法、电泳温度和时间、缓冲液离子度的改变、电泳薄膜的脱色及透明等诸多因素直接影响分析结果的准确性和重复性[2]。要使血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验顺利成功,就必须重视实验的各个环节,尤其在实验仪器、实验药品和载体、实验准备、学生操作等主要环节。经过多年反复实践,笔者认为“血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳”实验要取得成功应注意以下四个主要环节。

1.实验仪器方面应注意:

1.1电泳仪和电泳槽 北京六一仪器厂生产的DYY-Ⅲ8A稳压稳流定时电泳仪、电泳槽。每次试验开始或结束要注意将电泳仪的各个调节枢纽调至零点位置,电泳槽要用水洗净再用蒸馏水冲洗凉干,保护铂金丝,使之不被腐蚀。

1.2分析天平 上海天平仪器厂出产的TG328B分析天平。使用前进行调试,保证测定结果正确。

1.3分光光度仪 上海第三分析仪器厂制造的721分光光度计。使用前进行调试,保证称量数量准确。

2.实验药品和载体方面应注意:

2.1实验药品 用于配制缓冲液及染色液所用的药品,尽可能选择正规厂家生产的药品,试剂等级要求在AR或以上,而且要求配制缓冲液所需的巴比妥和巴比妥钠,两种药品尽可能为同一厂家生产,并注意有效期。

2.2载体 由于载体成分及做工不同,对血清蛋白吸附、分离等能力不同会造成电泳结果的差异[3]。因此,血清蛋白电泳所选用的载体-醋酸纤维素薄膜(我们选用浙江黄岩四青生化材料厂出品)的质量要求应该是质细、孔细、吸水性强、染料吸附量少、蛋白区带分离鲜明、对蛋白染色稳定者为佳。

3.试验准备时需注意:

3.1试剂准备 配制缓冲液的药品(巴比妥缓冲液-巴比妥/巴比妥钠,PH8.6、离子强度0.06)要求用分析天平称量,最好精确到0.001g。配制的缓冲液离子强度偏小易导致区带拖尾;若缓冲液离子强度偏大易导致区带过密。配制染色液的药品(氨基黑10B)也用分析天平称量,最好精确到0.01g。其它试剂可按照常规配制。

3.2电泳仪和电泳槽准备及电极的连接

3.2.1电泳仪的准备 首先检查电泳仪功能状态,将各个调节枢纽调至零点位置,使指针复位。

3.2.2电泳槽准备的准备 首先要用水洗净电泳槽,再用蒸馏水冲洗电泳槽后凉干,把洗净并折叠好的四层干沙布放在装有缓冲液的玻璃槽中浸泡,再置于电泳槽中的支架上搭桥,然后向两边的电泳槽中加入等体积的缓冲液至刻度线水平。

3.2.3电极的连接 最初两次电泳可按照“正常连接方式”将电泳仪上的电极连接于电泳槽的电极上。如果连续多次电泳则需要“调换电极连接方式”才能获得理想的电泳效果,否则要求更换电泳槽中的缓冲液。

4.学生操作时必须注意:

实验过程中正确指导学生操作是做好本试验的主要环节,必须加强对学生在准备、点样、电泳、通电、染色和漂洗、定量等步骤的指导,持别是在“点样”这一步骤。

4.1准备 将醋酸纤维素薄膜切割成2×8cm的矩形小孩子条,在其粗糙面的一端1.5cm处,用铅笔轻划一横线作为“加样位置”的记号,可以按照每位同学的学号进行编号,然后置于装有缓冲液的玻璃槽中浸泡并不断摇动5~10分钟,待薄膜充分浸透后,即膜条无白斑时,用摄子取出,夹于洁净的滤纸中间吸去多余的缓冲液。注意不能吸得太干以避免影响导电,点样薄膜过干,导致电泳图谱有条痕,亦不能留存过多缓冲液以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来。

4.2点样 掌握好点样技术是获得清晰电泳图谱的最重要环节。先取少量血清置于玻璃板上,用点样器(盖铝片制作)的钢口蘸取血清,然后将钢口平值“印”于点样线上(不可用力过大以避免弄破薄膜),待血清渗入薄膜后移开点样器。注意观查血清是否均匀地分布在点样线上,若有血清扩散或血清分布不均匀则废弃,重新选用另外一张准备好(指已浸泡透)的备用薄膜点样。

必须注意的是:点样时血清分布不均匀易导致电泳图谱不齐;点样时血清加样量过多易导致电泳图谱分离不良或中间颜色变浅;点样时血清加样量过少可导致电泳图谱染色过浅。这些因素会影响蛋白电泳的结果分析。因此,在实验操作时应指导学生掌握好加样量,以避免造成定量测定时产生结果误差。

4.3电泳 将已点样的薄膜端靠近阴极,粗糙面(即点样面)向下(防蒸干影响导电)平整地紧贴于电泳槽支架的“沙布桥”上。盖上盖子,平衡5分钟后通电。注意,电泳槽密闭不严,薄膜易蒸干,导致电泳图谱有条痕。

4.4通电 一般用电压130~160Ⅴ,若用电流则按照0.4~0.6毫安/厘米进

行换算。夏季通电40~50分钟,冬季通电60分钟左右。待电泳区带展开约3.5厘米时,将调节枢纽调至零点位置,然后切断电源。如出现电渗现象可增大电流量克服。但是,电流过大易导致电泳图谱有条痕。

4.5染色漂洗 小心从电泳槽中取出薄膜,直接浸于装置染色液的玻璃槽中,并轻轻不断摇动5分钟,待能看清楚蓝色的电泳区带后,取出并用漂洗液连续漂洗,直至薄膜底色漂净为止。即得五条蛋白色带。从远离点样端起依次为清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白。应注意的是染色时间不足够易导致染色后清蛋白中间颜色变浅。

4.6定量 将漂净的薄膜用滤纸吸干,由蛋白质区带分段剪下,分别浸入装有0.4mol/LnaOH溶液的试管中,清蛋白管用4ml,其余各管为2ml。振摇数次,约25分钟,蓝色即可完全浸出。用721分光光度计于580~620nm波长进行比色,蒸馏水调零,读取各管吸光度数,计算出白蛋白和各种球蛋白所占百分比。

4.7透明 如果需要保存电泳结果,可按照下列方法将薄膜透明:将染色、漂洗、干燥后(可用干燥箱干燥)的醋酸纤维素薄膜电泳图谱置于透明液中浸泡1~3分钟后取出,贴于玻璃板上,不要存在气泡。约2~3分钟薄膜便可完全透明,待干后撕下压平整,可供长期保存和直接用于光密度计扫描分析。

1.醋酸纤维素: 醋酸纤维素(CA)膜是由二醋酸纤维素和三醋酸纤维素的铸膜液及二者混合物浇铸而成。随着乙酰基含量的增加,盐截留率与化学稳定性增加而水通量下降。Loeb-Sourirajan 不对称结构是使用一“医用刮刀”(“doctor blade”)把CA、乙醇或乙醚溶液浇铸在一多孔基片(如帆布)上,表面经空气干燥产生一薄皮层而形成。在较大孔层之上的致密表皮是由约0.2μm厚的薄层组成,膜的总厚度约100μm.该技术也可用于管状的和中空纤维状膜的浇铸。

CA膜的化学稳定性差,在运转期间会发生水解, 其水解速度与温度及pH条件有关。醋酸纤维素膜可在温度0~30℃及pH值4.0~6.5下连续操作。这些东丽膜产品也会被生物侵蚀, 但由于它们具有可连续暴露在低含氯量环境下的能力,故可以消除生物侵蚀。膜稳定性差的结果导致膜截留率随操作时间增长而下降。然而, 这些材料的普及是由于它们具备广泛的来源和低廉的价格。

2.芳香聚酰胺:不对称芳香聚酰胺(Aramid)膜(Richter和Hoehn 1971)以中空纤维形式为所首创。这些纤维是由溶液纺丝而成。由控制纺丝液溶剂的蒸发在纤维外表面形成约0.1~1.0μm的致密表皮层。余下的纤维结构是约26μm厚的一层多孔支撑结构。盐的截流作用发生在致密层。为了进一步提高截留性能,当中空纤维膜用于苦咸水脱盐时,对膜采用聚乙烯基甲基醚(PT-A)进行后处理,用于海水脱盐则用PT-A与鞣酸(PT-A)作后处理。

与纤维素膜相比,芳香聚酰胺膜的特点是具有优良的化学稳定性。它们能在温度0~30℃ pH4~11件连续操作,且不会被生物侵蚀。然而芳香聚酰胺膜若连续暴露在含氯环境中,则易受氯侵蚀,因此,对他们处理的进料液进行脱氯是重要的。

3. 薄膜复合膜:美国内政部盐水局于年代中期基金资助的North Star Research 和Development Institute(位于 Minneapolis)的工作( Francis 1966Rozelle等 1967)导致了薄膜复合膜的发展。Universal Oil Products的 Fluid Systems Division( Riley等1967)在70年代中期推出了它的商品(薄膜复合物)膜,而FilmTec公司在80年代初期推出了它的FT30复合膜(Cadotte等1980) 。在这些膜结构中,超薄栅层在一多孔织物支撑体上的微孔聚砜表面上形成(即0.2μm厚)。该聚砜上的栅层是由聚酰胺或聚脲的就地界面聚合技术产生的。

薄膜复合膜的优点与它们的化学性质有关,其最主要的特点是有较大的化学稳定性,在中等压力下操作就具有高水通量和盐截留率及抗生物侵蚀。它们能在温度0~40℃及pH2~12间连续操作。像芳香聚酰胺一样,这些材料的抗氯及其他氧化物的性能差。 反渗透膜 (什么是反渗透膜?) 需要制成一定构型才可用于水处理。如今膜的构型主要有平板式,管式,卷式和中空纤维式,但常用于水处理的是卷式和中空纤维式两种。

对于卷式构型,常用膜有醋酸纤维素膜和复合膜,利用这些膜制成膜元件,把膜元件放在压力容器中构成膜组件。用于制作卷式构型的膜一般先制成平整的膜,醋酸纤维素膜的结构见图1,上部有一层致密的薄层(0.1-1.0μmm),即脱盐层,脱盐层下面有一层稍厚(100~200μm)的多孔支撑层,水很容易通过致密层流向多孔层。致密层是半透膜层,能有效阻止盐分的通过,起脱盐作用。

复合膜由三层组成,它们是:最上面的超薄脱盐层、中间的多孔的聚砜内夹层,最下面的聚酯支撑网层。由于聚酯支撑层不很平坦和多孔,不能用来直接支撑脱盐层,因而在该支撑层上面浇注一层聚砜微孔层,用于直接支撑脱盐层。聚砜层表面孔径可控制在0.015μm。脱盐层厚度为0.2μm,在聚砜层的支撑下,能承受较高的压力,抗机械压力和化学侵蚀能力强。

对于中空纤维构型,利用芳香族聚酰胺膜制成的众多中空纤维直接装配在压力容器内,构成用于水脱盐的基本单元--膜组件。

无论是卷式还是中空纤维式,对其构型的共同要求如下:

1) 对膜能提供适当的机械支撑,以便承受一定的给水压力

2) 能使给水,浓水和产品水各行其道,不混合

3) 使有一定压力的给水在通过膜面上时,能均匀分布,并有良好的流动状态,是浓差计划降至最低

4) 膜本身具有的脱盐率和透水量能在构型中得到充分的利用

5) 膜面积能得到最大限度的利用

6) 便于贮存,运输,装卸和更换

7) 易于制造,维护方便,牢固且安全可靠

8) 价格有竞争力。

1. 螺旋卷式

首先叙述卷式膜元件的概念。叶片有两张平展开的膜和一张聚酯织物组成,聚酯织物在两张膜的中间,叶片一端胶接起来形成一个袋,另一端(伸出来的聚酯织物)与带孔的PVC管粘接。叶片之间有塑料网,它们一起沿PVC中心管卷绕形成卷式构型。塑料端部装置粘接到卷式的叶片两端,一端起反伸缩装置(ATD)的作用,另一端起浓水密封的载体作用。玻璃钢(FRP)材料的外表面保护卷式构型。这样,形成了一个完整的膜元件。

卷式膜元件装入压力容器内试验,性能符合要求即可出售。前面提到的聚酯织物是起产品水收集通道的作用。塑料网一是作为浓水(给水)通道二是起加强给水通道水流紊动的作用,以便把浓差极化减少到最低程度。因为卷式反渗透装置的给水从膜元件的给水端流向浓水端,并平行于膜表面,这种水流方向就有浓差极化的倾向,因而叶片之间的塑料网是极为重要的。

卷式膜元件广泛用于苦咸水的脱盐,用于要求产水量较大的脱盐时,通常使用直径为101.6mm(4in) 或203.2mm(8in ),长度为1016mm (40in)或1524mm(60in)的膜元件。

把一个或几个膜元件连接起来,装在圆筒形的压力容器内,即构成卷式膜组件。

压力给水进入第一个膜元件,并在该膜元件的螺旋卷绕之间的通道内流动。一部分给水渗透过膜,并通过卷式通道流到膜元件中心的产品水收集管,另一部分给水沿着膜元件长度方向继续流动至第二个膜元件,这一过程依次进行。每个膜元件的产品水通过公共产品水管流成。当给水每通过下一个膜元件时,给水浓度增大,流过最后一个膜元件时,给水成为浓水,并排出压力容器。

2. 中空纤维式:

众多中空纤维膜装配在压力容器内构成中空纤维式膜组件。如今常用的是杜邦公司生产的用于苦咸水脱盐的B-9型中空纤维膜组件,现以此为例说明。中空纤维外径为85μm,内径为42μm,壁厚为21.5μm。该纤维在其表面有一层很薄得致密层(即芳香族聚酯胺膜的脱盐层),该层用以阻止盐的透过,而能使水流稳定通过。在此薄层下面有一较厚的同样材料的多孔层,用来支撑脱盐层。该层能让水通过它流至中空纤维的内孔。

中空纤维比人的头发还细,尽管其壁薄,外径与内径比率差少为2:1,犹如厚壁圆柱,但其有自支撑作用,且强度足够承受较高的压力而不变形,不损坏。

对处理水量较大的系统,可使用102×1194或203×1219的膜组件。压力容器内几乎全部充满纤维束,在纤维之间有约25μm的水通路。纤维束间是用无纺布隔开的,然后缠绕,整个纤维束分24层,纤维束最外层包有导流网,以利浓水导流。,空心纤维在压力容器内呈U型平行排列,在纤维中间的进水管道的一端用于进加压后的给水,另一端封堵密封,在其长度方向上有很多孔。纤维束的U型底部一端用环氧树脂固定密封,另一端通过环氧树脂板固定,并敞开中空纤维孔。进水管道内的水径向流往纤维束里的许多纤维。有一部分水渗透进中空纤维孔内,成为产品水,经环氧树脂圆环引出,另一部分在纤维束外边缘(即压力容器内边缘)轴向流往压力容器的端部,成为浓水,不断排走,并依靠O型密封环防止给水,浓水和产品水的混合。 组合 基材 涂层 1 玻璃纤维 聚四氟乙烯 2 玻璃纤维 氟化树脂 3 玻璃纤维 聚氯乙烯 4 聚酯类纤维 聚氯乙烯 5 聚乙烯醇类纤维 聚氯乙烯 6 聚酰胺类纤维 聚氯乙烯 注:表中的氟化树脂是指除了聚四氟乙烯以外的氟化树脂 。


欢迎分享,转载请注明来源:夏雨云

原文地址:https://www.xiayuyun.com/zonghe/482837.html

(0)
打赏 微信扫一扫微信扫一扫 支付宝扫一扫支付宝扫一扫
上一篇 2023-06-09
下一篇2023-06-09

发表评论

登录后才能评论

评论列表(0条)

    保存